ปัญหาเกี่ยวกับ PCR มาแลกเปลี่ยนกัน...อีกแล้ว

ไม่ได้จับงานนี้มาเกือบสิบปีแล้ว แต่ก็ยังได้ตอบคำถามอยู่เสมอ รู้สึกว่าความรู้พื้นฐานและประสบการณ์ รวมทั้งการหาความรู้เพิ่มเติมเมื่อเราพบปัญหา ทำให้เรายังสามารถตอบคำถามเกี่ยวกับการทำงาน PCR ได้อยู่นะคะ ไม่ได้ทำงานด้านนี้ในเมืองไทยเลย ไม่แน่ใจว่าเรามีพื้นที่สำหรับแลกเปลี่ยนปัญหากันเหมือนของฝรั่งหรือเปล่า เพราะถ้าเราหาด้วยภาษาอังกฤษ เราจะพบคำตอบได้หลายๆที่มาก บางที่ก็เป็น forum ใหญ่ๆที่อ่านแล้วได้ความรู้ที่มาจากประสบการณ์จริงๆ ไม่มีเขียนบอกในตำรา

ลองหาดูด้วยภาษาไทย พบอยู่ 2 ที่ ซึ่งเนื้อหาถือว่าดีทีเดียว คือ ที่นี่ (เขียนดีใช้ได้ แต่เสียที่ไม่มีระบุว่าใครเป็นคนเขียน เอกสารอ้างอิงว่ามาจากไหน) กับในเอกสารเรื่อง ความรู้พื้นฐานของเทคนิคพีซีอาร์ ของ Gibthai Training Center อันนี้ก็เขียนได้ดีนะคะ ไม่ใช่การแปลตำรามาอย่างเดียว มีรายละเอียดอธิบายว่าแต่ละขั้นตอนการทำงานของ PCR และคุณสมบัติต่างๆสำหรับส่วนประกอบของการทำ PCR มีไว้เพื่ออะไร คนที่ทำงานด้านนี้ลองอ่านและทำความเข้าใจเรื่องพื้นๆแบบนี้เอาไว้ จะทำให้สามารถวิเคราะห์ปัญหาที่พบเจอและหาวิธีแก้ไขได้ง่ายขึ้นค่ะ

ปัญหาของการทำ PCR เท่าที่พบมา จะไม่สามารถแก้ได้ด้วยการทำตามคนอื่นเป๊ะๆ แต่เป็นการวิเคราะห์ปัญหาที่เกิดขึ้นว่า มีสาเหตุมาจากอะไรได้บ้าง อธิบายให้ได้ ก็จะแก้ปัญหาได้ถูกทาง และหากแก้ปัญหาไม่เป็นระบบ ไม่ถูกจุด ไม่จัดลำดับให้ดี ก็อาจจะหลงทางได้ง่าย ทำให้กลายเป็นเรื่องยากขึ้นมาทันที เคยพบรุ่นน้อง (คนออสเตรเลีย) ที่เขาทำแล็บด้านนี้ เจอปัญหายาวนาน แก้แล้วแก้อีกหลายสัปดาห์ไม่สำเร็จ งานไม่เดินสักที ท้อแท้จนเกือบจะเลิกทำ แต่พอมาปรึกษาเรา ได้ขอให้เขาเล่าตั้งแต่ต้น ไม่ใช่แก้ปัญหาเฉพาะที่กำลังเจอ แล้วเริ่มต้นใหม่เลยจากพื้นฐาน ไม่ใช่หาข้อบกพร่อง ปรับของที่ทำอยู่ ก็พบว่างานเดินได้อย่างรวดเร็ว ทำให้รู้สึกเลยว่างาน PCR เป็นงานหนึ่งที่ต้องทำทุกขั้นตอนอย่างเข้าใจ การแก้ปัญหาไม่สามารถทำได้หากไม่เข้าใจพื้นฐาน ยิ่งแก้จะยิ่งยุ่งยาก ต้องจัดระบบความคิดและงานที่ต้องทำให้ดีๆ เข้าใจให้ถ่องแท้ว่า การตั้งค่าต่างๆ การใส่ส่วนผสมต่างๆ ทำไปเพื่ออะไร เป็นงานที่ต้องใช้ทั้งศาสตร์และศิลป์จริงๆ ไม่ใช่งานแล็บที่จะหยดๆหยอดๆกดๆจิ้มๆ แล้วจะได้ผลงานดั่งใจในทันทีเหมือนที่เห็น เชื่อว่าคนที่ทำงานด้านนี้มาแล้ว อ่านที่เขียนนี้จะเข้าใจแน่นอนค่ะ

เริ่มเปิดบันทึกใหม่ เพราะเห็นว่าที่บันทึกก่อนหน้านี้ มีคำถามที่เยอะมากจนอาจจะตามไปตอบไม่ถึงแล้ว ควรจะเริ่มใหม่ดีกว่า ประเดิมด้วยคำถามที่ได้รับทางเมล ซึ่งตอบไปแล้วก็คิดว่า น่าจะมีประโยชน์กับคนอื่นๆที่เริ่มทำงานด้านนี้ด้วย เลยขอเอามาแปะเผื่อแผ่กันไว้ตรงนี้ เพื่อแลกเปลี่ยนนะคะ อยากให้คนทำแล็บ PCR ของเรา ช่างแลกเปลี่ยนด้วยจะดีมาก อย่าเพียงมาหาคำตอบ แต่ควรแลกเปลี่ยนสิ่งที่ได้เรียนรู้และช่วยคนอื่นต่อๆไปด้วย เพราะงานแบบนี้ยิ่งช่วยคิด ช่วยแก้ปัญหาให้คนอื่น แล้วรู้ผลที่เกิดขึ้นด้วย เราจะยิ่งได้ความรู้มากขึ้นค่ะ

[โอ๋-อโณ]

เนื้อหาคำถามที่ได้รับทางเมล...

สวัสดีค่ะ อาจารย์

หนูชื่อ...........น่ะค่ะ พอดีได้อ่านเพจต่างๆที่เกี่ยวกับ PCR ค่ะ และเห็นอาจารย์เข้ามาตอบเยอะมาก เลยขอติดตามน่ะค่ะ และพอดีมีเรื่องที่เกิดข้อสงสัยในการทำ PCR นิดหน่อยค่ะที่อยาจะรบกวนถามอาจารย์ คืออยากจะทราบว่าพอเรา Run PCR แล้วจะจะทราบได้ยังไงค่ะว่าแบรนไหนดีหรือไม่ดี คือตอนนี้หนูกำลังจะทำ real-time PCR แต่ว่าก่อนทำเราต้องมี standard ที่เรามาใช้ในการ run ตอนนี้กำลังถึงขึ้นตอนการเตรียม std ค่ะ

เริ่มจาการที่ได้ pool DNA Template ของตัวอย่างแล้วโดยทำให้ตัวอย่างแต่ละตัวมีความเข้มข้นเดียวกันคือ 10 ng/ul หลังจากนั้นจึงได้เอาตัวที่อย่างที่ pool เสร็จแล้วไปทำ PCR product โดยที่มี primer ทั้งหมด 6 primers ซึ่งใช้ condition ดังไฟล์ที่แนบมาน่ะค่ะ ซึ่งใน cycle1 บางงานเขาก็ใช้ที่อุณหภูมิ 94 องศา 5 นาที บางงาน็ใช้ที่อุณหภูมิที่ 95 องศา 4 นาที (คำถามคือมันแตกต่างกันไหมค่ะ) และcycle ที่ 2 นั้นบางงานก็ใช้ 35X, 40X, 45X แตกต่างกันไป อยากทราบว่าขั้นตอนนี้เราต้องเลือกใช้อย่างไรค่ะ ส่วนในส่วนของ annealing temperature เราก็ใช้ตามอุณหภูมิทีเขาระบุมาในงานทดลองต่างๆใน primer เดียวกันได้เลยใช่ไหมค่ะ

คือตอนนี้ run PCR ไปแล้ว 2 รอบผลที่ได้เป็นตามที่แนบมาค่ะ ซึ่งในตอนแรกก็ยังมึนๆว่าเราต้องใช้ DNA template ปริมาณเท่าไหร่ ก็เลย เปรียบเทียบที่มีการใช้ DNA template ที่ 3 ความเข้มข้น ( ในส่วนนี้เราจะทราบได้ยังไงค่ะว่าความเข้มข้นไหนดีที่สุด เมื่อดูจากการ run gel แล้ว ) แต่ในที่นี้ได้เลือกความเข้มข้นทีใส่ DNA template ไป 2.5 ไมโครลิตร และ master mix 22.5 ไมโครลิตร พอrun gel แล้วได้ผลตาม gel รูปที่ 2 (คำถามข้อนี้คือเราจะทราบได้ยังไงค่ะว่าเราจะใช้แบรนนี้ในการที่ตัดแบรนไปทำ standard ได้รึป่าว หรือต้องเพิ่มความเข้มข้นของ DNA template ไหม หรือต้อง load DNA product ในgel เพิ่มขึ้น อันนี้โหลดไป 4 ไมโครลิตร

คำตอบ...

ดูจากในไฟล์ที่ส่งมา ต้องขอชมว่าหนูทำอะไรเป็นระบบดีมากค่ะ แต่อาจจะยังขาดความเข้าใจพื้นฐานเกี่ยวกับ PCR พี่ขอแนะนำให้หนูไปลองเปิดอ่านที่พี่เขียนเป็นเอกสารไว้ดูนะคะ ที่ https://goo.gl/XPsNLE

ตอบคำถามหนูคร่าวๆนะคะ

-อยากจะทราบว่าพอเรา Run PCR แล้วจะจะทราบได้ยังไงค่ะว่าแบรนไหนดีหรือไม่ดี

แบนด์ (band) ไม่ใช่แบรนนะคะ ถ้าใช้การดูจาก gel อย่างเดียวว่าดีหรือไม่ดี ก็ต้องใช้ขนาดกับความคมชัดไม่มี contaminate ค่ะ เทียบกับ DNA marker ว่าขนาดตรงกับ product ที่เราต้องการ ได้ผลผลิตคมชัดสามารถตัดเอามาสกัดเป็น pure product ได้ ที่พี่เคยทำก็คือควร sequence ดูว่าใช่จริง โดยเฉพาะที่เราต้องการเอาไปทำ std น่ะค่ะ (ทำครั้งแรกครั้งเดียวได้ค่ะ ว่า condition นี้ product size นี้ เป็น target ของเราจริงๆ)

-ซึ่งใน cycle1 บางงานเขาก็ใช้ที่อุณหภูมิ 94 องศา 5 นาที บางงาน็ใช้ที่อุณหภูมิที่ 95 องศา 4 นาที (คำถามคือมันแตกต่างกันไหมค่ะ)

ใน cycle แรกนั้นเรา denature เพื่อให้สาย DNA template มันแยกกันดีๆ การเลือกใช้ อุณหภูมิและเวลาจึงขึ้นกับวัตถุประสงค์นี้น่ะค่ะ และขึ้นกับ template ของเราว่าชอบแบบไหน ต้องลองดูเองค่ะ PCR เป็นเรื่องที่เรียกว่า empirical มากๆ (คือต้องลองเอง มันจำเพาะกับสิ่งที่เราทำมากค่ะ บางทีดีกับเรา คนอื่นเอาไปทำอาจจะต้องปรับ มีหลายปัจจัยมาก ถ้าหนูเคยอ่านที่พี่เขียน อาจจะพอเข้าใจค่ะ)

-cycle ที่ 2 นั้นบางงานก็ใช้ 35X, 40X, 45X แตกต่างกันไป อยากทราบว่าขั้นตอนนี้เราต้องเลือกใช้อย่างไรค่ะ

cycle ที่ 2 นี้มีไว้เพื่อเพิ่มจำนวน product ที่เราต้องการ ยิ่งมากรอบก็ยิ่งได้มาก (ขึ้นกับปริมาณ primer และ condition ของแต่ละ primer ด้วยค่ะ บางอย่างอาจจะมากรอบ แล้วได้ primer-dimer มากก็มี หรือถ้า dNTPs ไม่พอก็อาจจะไม่ได้ target มากก็ได้) ต้องทดลองดูเองกับงานของเราค่ะ ว่าแบบไหนเหมาะกับงานของเราที่สุด

- ส่วนในส่วนของ annealing temperature เราก็ใช้ตามอุณหภูมิทีเขาระบุมาในงานทดลองต่างๆใน primer เดียวกันได้เลยใช่ไหมค่ะ

ควรจะได้ค่ะ แต่ก็ต้องทดลองดูเองในขั้นแรกค่ะ จากประสบการณ์ที่พี่เคยทำมา บางทีก็ต้องปรับลด เพิ่ม แล้วจะได้ target ดีขึ้น ก็เคยเจอค่ะ ขึ้นกับว่าเรามีเวลาทดลองตอน optimization conditions ต่างๆว่าในสภาพของแล็บเราได้แบบนั้นไหมน่ะค่ะ

-เปรียบเทียบที่มีการใช้ DNA template ที่ 3 ความเข้มข้น ( ในส่วนนี้เราจะทราบได้ยังไงค่ะว่าความเข้มข้นไหนดีที่สุด เมื่อดูจากการ run gel แล้ว )

อันนี้ตอบไปในข้อแรกแล้วนะคะ หนูน่าจะมาถูกทางแล้วค่ะ

-คำถามข้อนี้คือเราจะทราบได้ยังไงค่ะว่าเราจะใช้แบรนนี้ในการที่ตัดแบรนไปทำ standard ได้รึป่าว หรือต้องเพิ่มความเข้มข้นของ DNA template ไหม หรือต้อง load DNA product ในgel เพิ่มขึ้น

ต้อง confirm ตามที่พี่อธิบายในข้อแรกน่ะค่ะ ส่วนเรื่องความเข้มข้นที่ใช้ ต้องทำการ optimize แบบเป็นระบบอย่างที่หนูทำนี่แหละค่ะ แล้วเราก็จะสามารถเลือก conditions และ concentrations ต่างๆที่ทำให้เราได้ target product ที่เราต้องการได้ดีที่สุด

เท่าที่อ่านคำถามหนู พี่คิดว่าหนูควรหาความรู้พื้นฐานเกี่ยวกับ PCR อีกสักนิดนะคะ ให้รู้ว่าเราทำอะไร ขั้นตอนไหนไปเพื่ออะไร เพราะงาน PCR เป็นเรื่องของการใช้ความรู้พื้นฐานมากๆมาประยุกต์ ถ้าเราเข้าใจ เราจะปรับเปลี่ยนอะไรๆได้ง่าย อ่านสิ่งที่คนอื่นทำได้เข้าใจมากขึ้น สามารถเอามาปรับใช้กับงานของเราได้ง่ายขึ้นด้วยค่ะ

ลองอ่านบันทึกของพี่เล่นๆดูก็ได้ค่ะที่นี่ https://www.gotoknow.org/blog/moleculartechnology

อาจจะช่วยให้เข้าใจบางอย่างเพิ่มขึ้นค่ะ

[sr]

Don't know much about PCR (DNA copying machine?).

But this I know:

Best Wishes and Happy New Year! ;-)

[นงนาท สนธิสุวรรณ]