เนื้อหาคำถามที่ได้รับทางเมล...

สวัสดีค่ะ อาจารย์

หนูชื่อ...........น่ะค่ะ พอดีได้อ่านเพจต่างๆที่เกี่ยวกับ PCR ค่ะ และเห็นอาจารย์เข้ามาตอบเยอะมาก เลยขอติดตามน่ะค่ะ และพอดีมีเรื่องที่เกิดข้อสงสัยในการทำ PCR นิดหน่อยค่ะที่อยาจะรบกวนถามอาจารย์ คืออยากจะทราบว่าพอเรา Run PCR แล้วจะจะทราบได้ยังไงค่ะว่าแบรนไหนดีหรือไม่ดี คือตอนนี้หนูกำลังจะทำ real-time PCR แต่ว่าก่อนทำเราต้องมี standard ที่เรามาใช้ในการ run ตอนนี้กำลังถึงขึ้นตอนการเตรียม std ค่ะ </wbr></wbr></wbr></wbr>

เริ่มจาการที่ได้ pool DNA Template ของตัวอย่างแล้วโดยทำให้ตัวอย่างแต่ละตัวมีความเข้มข้นเดียวกันคือ 10 ng/ul หลังจากนั้นจึงได้เอาตัวที่อย่างที่ pool เสร็จแล้วไปทำ PCR product โดยที่มี primer ทั้งหมด 6 primers ซึ่งใช้ condition ดังไฟล์ที่แนบมาน่ะค่ะ ซึ่งใน cycle1 บางงานเขาก็ใช้ที่อุณหภูมิ 94 องศา 5 นาที บางงาน็ใช้ที่อุณหภูมิที่ 95 องศา 4 นาที (คำถามคือมันแตกต่างกันไหมค่ะ) และcycle ที่ 2 นั้นบางงานก็ใช้ 35X, 40X, 45X แตกต่างกันไป อยากทราบว่าขั้นตอนนี้เราต้องเลือกใช้อย่างไรค่ะ ส่วนในส่วนของ annealing temperature เราก็ใช้ตามอุณหภูมิทีเขาระบุมาในงานทดลองต่างๆใน primer เดียวกันได้เลยใช่ไหมค่ะ </wbr></wbr></wbr></wbr></wbr>

คือตอนนี้ run PCR ไปแล้ว 2 รอบผลที่ได้เป็นตามที่แนบมาค่ะ ซึ่งในตอนแรกก็ยังมึนๆว่าเราต้องใช้ DNA template ปริมาณเท่าไหร่ ก็เลย เปรียบเทียบที่มีการใช้ DNA template ที่ 3 ความเข้มข้น ( ในส่วนนี้เราจะทราบได้ยังไงค่ะว่าความเข้มข้นไหนดีที่สุด เมื่อดูจากการ run gel แล้ว ) แต่ในที่นี้ได้เลือกความเข้มข้นทีใส่ DNA template ไป 2.5 ไมโครลิตร และ master mix 22.5 ไมโครลิตร พอrun gel แล้วได้ผลตาม gel รูปที่ 2 (คำถามข้อนี้คือเราจะทราบได้ยังไงค่ะว่าเราจะใช้แบรนนี้ในการที่ตัดแบรนไปทำ standard ได้รึป่าว หรือต้องเพิ่มความเข้มข้นของ DNA template ไหม หรือต้อง load DNA product ในgel เพิ่มขึ้น อันนี้โหลดไป 4 ไมโครลิตร </wbr></wbr></wbr></wbr></wbr>

คำตอบ...

ดูจากในไฟล์ที่ส่งมา ต้องขอชมว่าหนูทำอะไรเป็นระบบดีมากค่ะ แต่อาจจะยังขาดความเข้าใจพื้นฐานเกี่ยวกับ PCR พี่ขอแนะนำให้หนูไปลองเปิดอ่านที่พี่เขียนเป็นเอกสารไว้ดูนะคะ ที่ https://goo.gl/XPsNLE </wbr></wbr></wbr></wbr>

ตอบคำถามหนูคร่าวๆนะคะ

-อยากจะทราบว่าพอเรา Run PCR แล้วจะจะทราบได้ยังไงค่ะว่าแบรนไหนดีหรือไม่ดี</wbr>

แบนด์ (band) ไม่ใช่แบรนนะคะ ถ้าใช้การดูจาก gel อย่างเดียวว่าดีหรือไม่ดี ก็ต้องใช้ขนาดกับความคมชัดไม่มี contaminate ค่ะ เทียบกับ DNA marker ว่าขนาดตรงกับ product ที่เราต้องการ ได้ผลผลิตคมชัดสามารถตัดเอามาสกัดเป็น pure product ได้ ที่พี่เคยทำก็คือควร sequence ดูว่าใช่จริง โดยเฉพาะที่เราต้องการเอาไปทำ std น่ะค่ะ (ทำครั้งแรกครั้งเดียวได้ค่ะ ว่า condition นี้ product size นี้ เป็น target ของเราจริงๆ)</wbr>

-ซึ่งใน cycle1 บางงานเขาก็ใช้ที่อุณหภูมิ 94 องศา 5 นาที บางงาน็ใช้ที่อุณหภูมิที่ 95 องศา 4 นาที (คำถามคือมันแตกต่างกันไหมค่ะ)

ใน cycle แรกนั้นเรา denature เพื่อให้สาย DNA template มันแยกกันดีๆ การเลือกใช้ อุณหภูมิและเวลาจึงขึ้นกับวัตถุประสงค์นี้น่ะค่ะ และขึ้นกับ template ของเราว่าชอบแบบไหน ต้องลองดูเองค่ะ PCR เป็นเรื่องที่เรียกว่า empirical มากๆ (คือต้องลองเอง มันจำเพาะกับสิ่งที่เราทำมากค่ะ บางทีดีกับเรา คนอื่นเอาไปทำอาจจะต้องปรับ มีหลายปัจจัยมาก ถ้าหนูเคยอ่านที่พี่เขียน อาจจะพอเข้าใจค่ะ)</wbr>

-cycle ที่ 2 นั้นบางงานก็ใช้ 35X, 40X, 45X แตกต่างกันไป อยากทราบว่าขั้นตอนนี้เราต้องเลือกใช้อย่างไรค่ะ</wbr>

cycle ที่ 2 นี้มีไว้เพื่อเพิ่มจำนวน product ที่เราต้องการ ยิ่งมากรอบก็ยิ่งได้มาก (ขึ้นกับปริมาณ primer และ condition ของแต่ละ primer ด้วยค่ะ บางอย่างอาจจะมากรอบ แล้วได้ primer-dimer มากก็มี หรือถ้า dNTPs ไม่พอก็อาจจะไม่ได้ target มากก็ได้) ต้องทดลองดูเองกับงานของเราค่ะ ว่าแบบไหนเหมาะกับงานของเราที่สุด </wbr>

- ส่วนในส่วนของ annealing temperature เราก็ใช้ตามอุณหภูมิทีเขาระบุมาในงานทดลองต่างๆใน primer เดียวกันได้เลยใช่ไหมค่ะ </wbr>

ควรจะได้ค่ะ แต่ก็ต้องทดลองดูเองในขั้นแรกค่ะ จากประสบการณ์ที่พี่เคยทำมา บางทีก็ต้องปรับลด เพิ่ม แล้วจะได้ target ดีขึ้น ก็เคยเจอค่ะ ขึ้นกับว่าเรามีเวลาทดลองตอน optimization conditions ต่างๆว่าในสภาพของแล็บเราได้แบบนั้นไหมน่ะค่ะ</wbr></wbr>

-เปรียบเทียบที่มีการใช้ DNA template ที่ 3 ความเข้มข้น ( ในส่วนนี้เราจะทราบได้ยังไงค่ะว่าความเข้มข้นไหนดีที่สุด เมื่อดูจากการ run gel แล้ว )</wbr>

อันนี้ตอบไปในข้อแรกแล้วนะคะ หนูน่าจะมาถูกทางแล้วค่ะ

-คำถามข้อนี้คือเราจะทราบได้ยังไงค่ะว่าเราจะใช้แบรนนี้ในการที่ตัดแบรนไปทำ standard ได้รึป่าว หรือต้องเพิ่มความเข้มข้นของ DNA template ไหม หรือต้อง load DNA product ในgel เพิ่มขึ้น</wbr></wbr>

ต้อง confirm ตามที่พี่อธิบายในข้อแรกน่ะค่ะ ส่วนเรื่องความเข้มข้นที่ใช้ ต้องทำการ optimize แบบเป็นระบบอย่างที่หนูทำนี่แหละค่ะ แล้วเราก็จะสามารถเลือก conditions และ concentrations ต่างๆที่ทำให้เราได้ target product ที่เราต้องการได้ดีที่สุด</wbr>

เท่าที่อ่านคำถามหนู พี่คิดว่าหนูควรหาความรู้พื้นฐานเกี่ยวกับ PCR อีกสักนิดนะคะ ให้รู้ว่าเราทำอะไร ขั้นตอนไหนไปเพื่ออะไร เพราะงาน PCR เป็นเรื่องของการใช้ความรู้พื้นฐานมากๆมาประยุกต์ ถ้าเราเข้าใจ เราจะปรับเปลี่ยนอะไรๆได้ง่าย อ่านสิ่งที่คนอื่นทำได้เข้าใจมากขึ้น สามารถเอามาปรับใช้กับงานของเราได้ง่ายขึ้นด้วยค่ะ</wbr></wbr></wbr></wbr>

ลองอ่านบันทึกของพี่เล่นๆดูก็ได้ค่ะที่นี่ https://www.gotoknow.org/blog/moleculartechnology</wbr></wbr></wbr>

อาจจะช่วยให้เข้าใจบางอย่างเพิ่มขึ้นค่ะ</wbr>