GotoKnow
  • เข้าระบบ
  • สมัครสมาชิก
  • แผงจัดการ
  • ออกจากระบบ
GotoKnow

Flow Cytometry : Case study 2 กรณีเม็ดเลือดแดงแตกยากเหลือเกิน

เคยเขียนเรื่องเกี่ยวกับ  Flow Cytometry   ไว้บ้างเล็กน้อย ในนี้     ซึ่งถือเป็น case study 1    เมื่อสัปดาห์ที่แล้วเจออีกเรื่องหนึ่งเลยคิดว่าน่าจะบันทึกไว้เตือนความจำ   โดยจะบันทึกไว้ในหัวข้อ Flow Cytometry

น้องลิ-พนิดา  (คนเดิมกับในบันทึกอันก่อน)    มาบอกว่าขอปรึกหน่อย (ปรึกษา)   ว่ารายนี้  gate "lymphocyte"    ไม่ได้    มีกลุ่มก้อนของอะไรก็ไม่รู้...มาก่อกวนมากเหลือเกิน      ดูจากกระดาษที่ print ออกมาก็ดูไม่ออกว่ามันคืออะไร     แต่สังเกตจาก data rate (event  or cells/ sec)     เห็นว่าสูงมากๆ   ทั้งที่รายนี้มี WBC แค่ 2700 cells/cu.mm.   เลยบอกให้ย้อมเซลล์ใหม่

เมื่อนำเซลล์ที่ย้อมใหม่ไป  เข้าเครื่อง flow cytometer   อีกครั้งหนึ่ง    ปรากฏว่าให้ผลเหมือนเดิม  data rate สูงมากเป็น 2000     คิดๆ...หรือว่า...sample นี้จะมี nucleated red cell  เลยปรึกษาพี่ถ่าว-สมพร     พี่ถ่าวดูผล CBC แล้ว   ปรากฏว่าไม่ใช่    พี่ถ่าวให้ความเห็นว่าอาจจะเป็นเม็ดเลือดแดงที่ lyse ไม่หมด       แต่เรามองไม่เห็นว่า  lyse หมดหรือไม่   เพราะน้ำในหลอดทดลองเป็นสีแดง

ต้องเล่าย้อนถึงวิธีการย้อมเซลล์      การย้อมเซลล์เพื่อตรวจ CD4, CD8 นั้น   ทำได้โดย

  1. ใช้เลือดครบส่วน (EDTA blood)   เติม specific monoclonal antibody ที่ tag ด้วยสารเรืองแสงลงไป   ตามปริมาตรที่กำหนด    
  2. ตั้งให้ทำปฏิกิริยากัน   15 นาที
  3. เติม lysing buffer (ซึ่งมี formaldehyde อยู่ด้วย)    
    จากนั้นสามารถนำไปวิเคราะห์ผลได้เลย    หรือเก็บเข้าตู้เย็นเพื่อรอวิเคราะห์วันรุ่งขึ้นได้  

การย้อมแบบนี้ (no wash) เม็ดเลือดแดงจะถูกทำให้แตกหมด   เพื่อไม่ให้รบกวนการอ่านผล    แต่จะไม่มีการล้างเอาเศษเซลล์เหล่านี้ออก    (จะเห็นส่วนผสมในหลอดเป็นเลือดสีแดงๆ น่ากลัวดี)     การย้อมแบบ  นี้มีข้อดีคือลดขั้นตอน    แต่ข้อเสียคือ   เราจะไม่มีทางรู้ว่า  เม็ดแดงแตกหมดหรือไม่     ถ้าแตกไม่หมด....ปัญหาจะเกิด...อย่างรายนี้

วิธีแก้ไขมีสองแบบคือ

  1. ในการ analyse  จะต้องปรับค่าบางอย่าง (discriminate )   ให้สูงขึ้นเพื่อตัดเอาส่วนที่เป็น red blood cell ออกจากหน้าจอ (ส่วนที่จะนำมาวิเคราะห์ผล)    ให้เหลือเฉพาะของจริง (WBC)   พอทำแบบนี้เราจะเห็นบริเวณที่ควรจะเป็น lymphocyte ชัดเจน
  2. นำหลอดทดลองอันเดิมนั้น    มาปั่นล้างด้วย  ISOTON buffer     1-2 ครั้ง   ก็จะสังเกตเห็นตะกอน   ถ้าเม็ดเลือดแดงแตกไม่หมดจะเห็นตะกอนเซลล์เป็นสีแดง     สำหรับรายนี้ตะกอนเป็นสีแดง      เลยต้องเติม lysing buffer  ลงไปใหม่   แล้วตั้งไว้ข้ามคืน (ในตู้เย็น)    เม็ดเลือดแดงจะแตกหมด...ถ้ายังไม่แตก   ต้องเพิ่ม lysing buffer  ลงไปอีก   จนกว่าจะเห็นผล

เราทำทั้งสองวิธี    ค่าที่ได้ให้ผลใกล้เคียงกัน   แต่วิธีที่สองเสียเวลาและแรงงานมากไปหน่อย    และอีกอย่างการปั่นล้างหลายครั้งต้องระวัง    อาจไม่ดีต่อสุขภาพของผู้ทำแล็บ  (เลือดอาจฟุ้งกระจายเป็นละอองฝอย-เพิ่มความเสี่ยง)

Note : พี่ถ่าวให้ข้อสังเกตว่า  เลือดรายนี้มีเม็ดเลือดแดงเป็นแบบ hypo, aniso poiki, micro,spher  และ target 1+    เหล่านี้...เป็นสาเหตุที่ทำให้แตกยากหรือไม่ ?   

 

บันทึกนี้เขียนที่ GotoKnow โดย 

หมายเลขบันทึก: 61070
เขียน:
แก้ไข:
ความเห็น: 5
อ่าน:
สัญญาอนุญาต: สงวนสิทธิ์ทุกประการ

ความเห็น (5)

แหม...เห็นข้อสังเกตของคุณถ่าวแล้ว ต้องบอกว่า "ประสบการณ์สูง" จริงๆค่ะ
  • เห็นเรื่องเกี่ยวกับเม็ดเลือดแดงๆขาวๆแล้ว พี่เม่ยขอเข้ามาแจมด้วยนะ คุณ nidnoi...
  • ขอตอบข้อสังเกตคุณถ่าวให้สองประเด็นค่ะ
  1. ถ้า lysing buffer มีคุณสมบัติเป็น hypotonic solution ละก็ ข้อสังเกตนั้นเป็นจริงทุกประการ เพราะเม็ดเลือดแดงประเภท hypo, target, poly จะมีความจุภายในเซลล์มากกว่าเม็ดเลือดแดงปกติ ทำให้แตกยากกว่าค่ะ
  2. แต่ถ้า lysing buffer มีคุณสมบัติเป็นพวกที่ไปย่อยสลาย lipid bilayer ของเมมเบรน (เช่น quarternary amm.compound.) อันนี้เม็ดเลือดแดงแบบไหนก็แตกหมดค่ะ   ยกเว้นในบางรายที่เม็ดเลือดแดงอาจถูกเคลือบไว้ด้วยสารเคมีบางตัวในพลาสม่า เช่นยาบางตัว ระดับน้ำตาลที่สูงๆใน DM  หรือกลุ่มที่ได้รับยาเคมีบำบัดค่ะ  นานๆพบได้สักครั้งค่ะ
คาดว่าเป็นกรณีที่ 1. มากกว่าเนาะ ต้องไปดูส่วนประกอบของน้ำยา lysing ดูนะจ๊ะ
  • ปรากฎว่าคุณNidnoiเลยเก่งภาษาอังกฤษไปเลย
  • มีศัพท์เทคนิคมากเลย อาชีวะไม่มี
  • ขอบคุณมากครับผม
Dear พี่เม่ย
คำถามที่ว่า "เหล่านี้...เป็นสาเหตุที่ทำให้แตกยากหรือไม่ ? "
นั่นน่ะ    เพื่อพี่เม่ยโดยเฉพาะค่ะ   ถ้าพี่เม่ยไม่ตอบแล้วใครจะตอบล่ะหนอ
.
lysing solution เป็น commercial kit
มิได้บอกส่วนประกอบโดยละเอียด   บอกแต่ว่ามี
formaldehyde and   diethylene glycol
แต่โดยทั่วไป lysing solution  ที่ใช้ในงาน flow (กรณีเตรียมเอง)
จะเป็น  Ammonium chloride lysing solution
คือ   NH4Cl  และ  NaHCO3, dissolve in distilled water and  adjust pH to 7.4.
Dear Khun KAJIT
.
มิได้เก่งแต่อย่างใดค่ะ
ศัพท์พวกนี้ใช้กันอยู่เป็นธรรมดา  สามัญ  เพราะมันเป็นศัพท์เฉพาะ (ไม่ใช่ทั้งเทคนิคและอาชีวะ)  แปลเป็นไทยได้ยากยิ่ง
(ใช้บ่อยๆ  แต่ก็ยังเขียนผิดอยู่เป็นประจำ)
.
ขอบคุณเจ้าค่ะ
  • เป็นศัพท์ที่ผมแปลแล้ว
  • บางคำไม่เข้าใจจริงๆ
  • ขอบคุณครับ