บันทึกจากแดนซากุระ 19 : เมื่อมือใหม่ถูกลองของ (2)
จากบันทึกฉบับแรกว่าด้วยการถูกลองของ จบลงตรงที่ หาเจอแล้วว่าต้นตอของความวุ่นวายเกิดขึ้นจากสาเหตุของสิ่งปนเปื้อนใน taq polymerase จึงเปลี่ยน taq polymerase ใหม่ แล้วลองทำ PCR ในตัวอย่างตรวจดู 16 ตัวอย่าง สุดท้ายก็ต้องกุมขมับกลับบ้านอีกเมื่อยังเจอ contamination
ทีนี้ก็มาต่อภาคสอง (ตอนจบ) แสดงว่าหลังจากเปลี่ยน taq ใหม่แล้ว ก็ยังเกิด contamination อีก คราวนี้มันอยู่ในไหนหว่า ทางที่ดี ลอง repeat ใหม่อีกสักครั้ง ผลก็ยังคงมี contamination อยู่เหมือนเดิม แน่แล้วเราเจอของแข็งเข้าอีกแล้ว แล้วคราวนี้มัน contaminate ในไหนหว่า ก็เลยลองตรวจสอบน้ำยา buffer, dNTP และ Mg ก่อน โดยเปรียบเทียบระหว่างอันที่ใช้อยู่ปัจจุบันที่เกิด contamination กับหลอด stock ที่ไม่น่าจะมี contamination อย่างน้อยก็จะได้รู้ว่าเป็นเจ้าสามตัวนี่หรือเปล่า ผลปรากฏว่าทั้งน้ำยาเก่าและน้ำยาใหม่ เมื่อทำ PCR แล้ว positive control ให้ band สวยงามขณะที่ negative control ไม่พบ band ใดๆ เลย ไม่มี contamination ทั้งในหลอดเก่าและหลอดใหม่ อ้าว! แล้วที่ผ่านมา contamination มันมาจากไหน เอาล่ะถ้าจะโทษจริงๆ ก็คงต้องโทษคนทำแล้วล่ะ มันน่าจะเป็นจากเทคนิคที่ไม่ดีของคนทำแน่แล้ว แต่ไม่เป็นไรเมื่อมันไม่ contaminate แล้วก็ลองทำกับของตัวอย่างตรวจจริงๆ ดูก็แล้วกัน ว่าแล้วก็เลยไปเอาตัวอย่างตรวจมาทดลองทำ 8 ราย ไม่กล้าลองมากเดี๋ยวเจอ contamination อีก ทำน้อยๆก่อนก็แล้วกัน แต่ผลเจ้า 8 รายที่ทำนี้ ใน negative control ก็ยังเจอ band มหาประลัยอีก โอ๊ย! เหมือนถูกกลั่นแกล้ง เดี๋ยวก็ con เดี๋ยวก็ไม่ con ปวดหัวจัง ลองซ้ำในตัวอย่างตรวจอีกสักทีก็แล้วกัน ก็เลยทดลองทำซ้ำเจ้า 8 รายนั่นแหละ ผลก็ยังเป็นไปตามคาด ยังคงมี contamination ใน negative control (master mix) อยู่นั่นเอง เจ้าม้อยอีกแล้วที่เป็นพระเอกขี่ม้าขาวมาช่วย
"พี่ ไม่ต้องไปหาหรอกว่ามัน con จากไหน เปลี่ยนน้ำยาใหม่ให้หมดเลย แล้วลองเตรียม master mix ใน hood ดู ส่วน pipette tip ก็ใช้แบบที่มี filter ไปเลย" ว้าว! เพิ่มระดับการป้องกัน contamination ไปที่ระดับสูงสุดเชียว แล้วลองดูซิว่าคราวนี้จะ con อีกมั้ย
ปรากฏว่าคราวนี้ ไม่ con แล้ว positive control ให้ band สวย ขณะที่ negative control ไม่มี band ให้เห็น ลองซ้ำอีกสักครั้งก็ยังให้ผลเหมือนเดิม โอ! พระเจ้าจ๊อด มันยอดมาก ทีนี้ก็เริ่มทำของตัวอย่างจริงได้แล้วซิ ว่าแล้วก็เลยระดมทำของตัวอย่างจริงทั้งหมด 100 ราย โดยไม่เจอ contamination อีกเลย
mail ไปบอก sensei (แกไปเมืองไทย) ว่าแก้ปัญหาการ contamination ได้แล้ว โดยเตรียม master mix ใน hood และใช้ pipette tip แบบที่มี filter แล้วไม่พบ contamination อีกเลย นึกว่าแกคงดีใจที่เราแก้ไขปัญหาได้แล้ว แต่เปล่าเลย แก mail ตอบกลับมาว่า "ว่างๆ ก็ลองเตรียม master mix โดยไม่ใช้ hood และใช้ pipette ธรรมดาดูบ้าง" โถ sensei ก็เพิ่งทำ con มานี่เอง จะให้กลับไปลองแบบเดิมอีกแล้วเหรอ แต่ก็ OK ถือเป็นการทดลอง คนอื่นเขาทำได้ เราก็ต้องทำได้ซิ แต่ไว้วันหลังนะ ตอนนี้ขอทำไปข้างหน้าก่อนนะ sensei ถ้ามีเวลาแล้วจะกลับมาลองทำตามคำสั่ง...
หมายเหตุ high light สีแต่ละสีเป็นการทดลองทำแต่ละครั้ง
สรุป
1. contamination ครั้งแรกเกิดจากการ contamination ใน taq polymerase (ร้อยวันพันปี เจ้าตัวนี้ไม่ค่อย con กับเขาหรอก) แต่ผมมีความสามารถทำให้มัน con ได้
2. contamination ครั้งที่สอง ยังไม่รู้สาเหตุแน่ชัด แต่น่าจะเป็นจากเทคนิคของคนทำไม่ดี
3. แนวทางแก้ไขปัญหาที่เกิดขึ้น
- ใช้วิธีการเตรียม master mix ใน hood
- ใช้ pipette tip ชนิดที่มี filter ในการเตรียม master mix
- เพิ่มความระมัดระวังในการป้องกัน contamination ให้มากขึ้น โดยปรับปรุงเทคนิคการทำงาน ตอนหลังให้ม้อยมาดูเทคนิคการทำแล็บ ม้อยสงสัยว่า contamination น่าจะมาจากการที่ เอามือข้ามไปมาเหนือหลอด master mix ขณะที่ยังเปิดฝาอยู่
ความเห็น (5)
เท่าที่เคยมีประสบการณ์เกี่ยวกับการหา contaminate ใน PCR มา (ช่วยคนอื่น ตัวเองโชคดีมากที่ไม่เคยเจอเลย...เอ๊ะหรือเป็นคนเทคนิคดี..ต้องลอง AAR ดู) ยังไม่เคยเจอว่าใครหาสาเหตุได้เลยค่ะ ทุกรายที่ช่วย (จำจำนวนไม่ได้ แต่มากกว่า 5 ราย ทุกคนเป็นนักเรียนใหม่ระดับหลังปริญญาตรี และ...เป็นฝรั่ง) ถ้าไม่เอาผลที่เราทำแทน ก็คือเริ่มจากทุกอย่างใหม่หมดเลย
ตอนแรกที่อ่านบันทึกที่แล้วของคุณ mitoฯก็อยากออกความเห็นว่าอย่าเพิ่งดีใจเหมือนกันให้รอเวลาทำของจริงแล้วได้ผลเสร็จเสียก่อน อุตส่าห์คิดว่าอาจจะโชคดีที่หาเจอและเป็นตัวจริง เราจะได้บอกว่าเก่งกว่าที่เราเคยเจอมา
ถ้าให้ทำนายจะบอกว่า จะไม่เจออีกแล้ว เพราะทุกคนที่เคยช่วยก็เจอกันครั้งเดียวและหาต้นเหตุที่แท้จริงไม่ได้ เหมือนจะรับน้องนั่นแหละค่ะ
อะฮ่ะ..มีชื่อม้อยเข้าไปเกี่ยวข้องหลายตอนเลยต้องโผล่มารายงานตัวค่ะ
ม้อยก็เห็นด้วยกับอาจารย์น่ะค่ะว่าน่าจะลองทำนอก hood และใช้ tip แบบที่ไม่มี filter ดู เพราะว่าเวลาที่กลับไปบ้านเราจะได้ทำในห้องแลปธรรมดาที่เรามีอยู่ได้ ส่วนทิปแบบธรรมดานั้นเป็นการประหยัดต้นทุนมั้งค่ะ เพราะราคาต่างกันพอสมควรค่ะ แต่ม้อยไม่รู้ว่าเหตุผลของอาจารย์คืออะไรค่ะ เอาไว้อาจารย์กลับมาแล้วจะลองถามดูค่ะ
ยังงัยก็ตามการที่ได้ผล contaminate ในพีซีอาร์ก็เป็นการฝึกในเรื่องความระมัดระวังและการแก้ปัญหาที่เกิดขึ้นในการทำงานทางอณูชีววิทยาค่ะ เอาใจช่วยเสมอน่ะค่ะ
อะฮ่ะ..มีชื่อม้อยเข้าไปเกี่ยวข้องหลายตอนเลยต้องโผล่มารายงานตัวค่ะ
ม้อยก็เห็นด้วยกับอาจารย์น่ะค่ะว่าน่าจะลองทำนอก hood และใช้ tip แบบที่ไม่มี filter ดู เพราะว่าเวลาที่กลับไปบ้านเราจะได้ทำในห้องแลปธรรมดาที่เรามีอยู่ได้ ส่วนทิปแบบธรรมดานั้นเป็นการประหยัดต้นทุนมั้งค่ะ เพราะราคาต่างกันพอสมควรค่ะ แต่ม้อยไม่รู้ว่าเหตุผลของอาจารย์คืออะไรค่ะ เอาไว้อาจารย์กลับมาแล้วจะลองถามดูค่ะ
ยังงัยก็ตามการที่ได้ผล contaminate ในพีซีอาร์ก็เป็นการฝึกในเรื่องความระมัดระวังและการแก้ปัญหาที่เกิดขึ้นในการทำงานทางอณูชีววิทยาค่ะ เอาใจช่วยเสมอน่ะค่ะ
mitochondria
รบกวนถามผู้มีประสบการณ์ค่ะ คือตอนนี้ทำ Multiplex pcr เกี่ยวกับ bacteria แล้วเกิดปัญหาการ contaminate ค่ะ ที่ lab ใช้ master mix สำเร็จรูป เวลาจะทำ sample จะเตรียมทุกอย่าง (master mix, DW, primer) ให้เป็น tube เดียว และแบ่งใส่ลงในแต่ tube โดย negative control ใส่ DW แทน DNA และ มี tube negative control ที่ใส่ DNA ของเชื้อตัวอื่น ที่ต้องไม่ขึ้น ใน pcr (ที่ lab ทำทุกอย่าง ใน hood และ ใช้ fillter tip) ที่ผ่านมาไม่มี contaminate แต่ตอนนี้พบ contaminate ที่ negative control จาก tube ที่เติมน้ำ และ ที่ใส่ DNA เชื้อ negative ซึ่ง แบนที่พบ มีขนาดเท่าแบนของ tube positive control ทุกแบน และความเข้มของแบน ใกล้เคียงมาก
***ลองแก้ปัญหาโดยการเปลี่ยน master mix, DW, เตรียม stock primer ใหม่หมด แต่ผลออกมาเหมือนเดิมทุกประการ ยังเกิด contaminate แบบเดิม ไม่ทราบว่า ควรทำอย่างไรดีค่ะ ...รบกวนขอคำแนะนำด้วยค่ะ
(อยากร้องไห้เลย T^T)