ตั้งแต่ต้นอาทิตย์ก่อน ก็ได้มีโอกาสฝึกทำ PCR สำหรับ amplify บริเวณ D-loop ของ mitochondria เริ่มต้นก็หา optimal annealing temperature ครับ โดย vary อุณหภูมิจาก 50-70 C โชคดีที่ที่นี่มีเครื่อง Gradient PCR อยู่แล้ว เลยไม่เป็นงานหนัก เราก็เพียง set ในเครื่องว่าต้องการ vary อุณหภูมิจาก 50 ถึง 70 C เครื่องก็จะคำนวนให้เป็นช่วงห่างอุณหภูมิ 12 จุดและทำให้พร้อมกันทั้ง 12 จุดในการ run คราวเดียวกัน จากการทำในครั้งแรกพบว่า ช่วงอุณหภูมิต่ำๆ จะมี background โดยอุณหภูมิที่เริ่มไม่มี background คือตั้งแต่หลุมที่ 6 (58.4 C)เป็นต้นไป จนถึง 70 C ก็เลยเลือก annealing temp ที่ 70 C เพื่อให้สามารถรวบขั้นตอน annealing  กับ extension เข้าด้วยกัน จะได้ประหยัดเวลา แต่ปัญหาที่เริ่มก่อตัวขึ้นคือหลอด negative control (มีแต่ master mix ก็มองเห็น band จางๆ) เอาล่ะ เริ่มต้นมือใหม่ก็ถูกลองของเสียแล้ว
     เพื่อให้เรียนรู้ให้จบกระบวนการ ก็เลยยังคงเอา PCR product ไป reamplify ด้วย Bigdye v 1.1 แล้วแยกเฉพาะ PCR product ด้วยเทคนิค membrane filtration ซึ่งเป็นเทคนิคใหม่ ทำได้สะดวกกว่าการตกตระกอน DNA และใช้เวลาน้อยกว่าค่อนข้างมาก แล้ววันหลังจะเขียนเปรียบเทียบ 2 เทคนิคนี้ให้ฟัง จากนั้นก็เอาเข้าเครื่อง DNA Sequencer ก็สวยงามครับ มี peak ขึ้นสวยงามอ่านได้ชัดเจน เอา sequence ที่ได้ไปเทียบกับ sequence ใน genebank ก็เป็นของ mitochondria ของคน ถูกต้องสวยงามครับ
     ที่นี้กลับมาที่จุดตั้งต้นของปัญหา เจ้า contamination มาจากไหน?
     ว่าแล้วก็เลยกลับมาลองทำ PCR ใหม่ ปรากฏว่า Positive control มี band สวยงามครับ เจ้า Negative control (master mix อย่างเดียว) ก็มี band สวยงามไม่แพ้กัน ตำแหน่งเดียวกันด้วย แน่นอนแล้ว contamination มาเยือนแล้ว  แล้วมัน con มาจากไหน คำถามที่ยากที่จะตอบ ต้องหาอย่างเดียวเท่านั้น ทำอย่างไรดี
    1. Clean autopipette เรียบร้อยแล้ว step นี้ทำก่อนเพื่อนเลย
    2. เปลี่ยน Buffer, dNTP, Mg, Taq, DDW ที่ไม่ได้เปลี่ยนก็คือ คนทำ กับ primer เพราะมีเพียงชุดเดียว แล้วทำเทียบระหว่าง reagent ใหม่ กับ reagent เก่า ปรากฎว่าผลก็ยังออกมาเหมือนเดิมครับ ทั้ง PC และ mastermix ของทั้ง reagent เก่าและใหม่ มี band ขึ้นพร้อมกัน แข่งกันงาม เอาละปัญหานี้ถ้าไม่ใช่คนทำก็ primer แล้วล่ะ เพื่อให้แน่ใจขอลองดูอีกที อาจจะเป็นที่น้ำกลั่นก็ได้
    3. ไปขอน้ำกลั่นห้องม้อยมา (แน่ใจว่าน้ำกลั่นห้องม้อยไม่ con แน่ๆ) แล้วมาทำเปรียบเทียบดังนี้
     - กลุ่มที่ 1 ทำ PC และ NC โดยใช้ น้ำกลั่นห้องม้อย และ reagent ใหม่ (buffer, dNTP, Mg)
     - กลุ่มที่ 2 ทำ PC และ NC โดยใช้ น้ำกลั่นห้องผม และ reagentใหม่ (buffer, dNTP, Mg)
     - กลุ่มที่ 3 ทำ PC และ NC โดยใช้ น้ำกลั่นห้องม้อย และ reagent ใหม่ (buffer, dNTP, Mg) แต่เปลี่ยน primer ใหม่ โดย dilute จาก stock ใหม่
     ผลปรากฏว่า คุณเธอพร้อมใจนัดกันมาเพียบ ทุกหลอดขึ้น band สวยงาม สรุปว่า ถ้าไม่คอนที่คนทำก็น่าจะเป็น stock ของ primer แล้วล่ะ  เพื่อพิสูจน์ตรงนี้ ก็เลย
     4. เอา primer ที่ dilute แล้ว ไปหาม้อย น้องจ๋าช่วยพี่หน่อย ม้อยก็เลยช่วยทำให้โดยใช้ reagent ของม้อยทุกอย่าง แต่ใช้ primer ของผม ผมก็นั่งเชียร์อยู่ให้มัน con ที่ primer เถอะจะได้สั่งใหม่ หมดเรื่องหมดราว
     ผลปรากฏว่า เหมือนถูกม้อยแกล้ง ม้อยทำออกมา master mix ไม่เห็นจะมีสัก band ใสกระจ่าง เอาแล้ว ไม่ใช่ primer แน่ๆ แล้วเป็นที่อะไร ก็เลยขอชุดน้ำยาที่ม้อยทำทุกอย่างมาลองดู (buffer, dNTP, Mg, taq)
     5. เพื่อให้แน่ใจว่า มัน con อยู่ในชุดน้ำยาของผมหรือเป็นจากตัว autopipette ที่ห้องผม ก็เลยขอลองดูให้แน่ใจ
     - กลุ่มที่ 1 ทำ PC และ NC โดยใช้ชุดน้ำยาของม้อย ผมไปนั่งทำที่ห้องม้อยเลยครับ ใช้ pipette ของม้อย
     - กลุ่มที่ 2 ทำ PC และ NC โดยใช้ชุดน้ำยาของม้อย แต่เอามาทำที่ห้องผม ใช้ pipette ของผม
     - กลุ่มที่ 3 ทำ PC และ NC โดยใช้ชุดน้ำยาของผม และทำที่ห้องผม ใช้ pipette ของผม
     ผลปรากฎว่า ชุดน้ำยาของม้อย NC ไม่มี band ครับ ส่วนชุดน้ำยาของผม NC มี band สวยงามครับ แน่ใจได้แล้วว่า ชุดน้ำยาที่ผมมีอยู่ มี contamination โดยไม่ใช่ที่ตัว autopipette แล้วเจ้าตัวที่น่าสงสัยที่สุดในความเห็นของผมก็เป็น taq polymerase
    6. ทดลองทำอีกครั้ง
     - กลุ่มที่ 1 ทำ PC และ NC โดยใช้น้ำยาใหม่ กับ taq ใหม่
     - กลุ่มที่ 2 ทำ PC และ NC โดยใช้น้ำยาใหม่ กับ taq เก่า
     - กลุ่มที่ 3 ทำ PC และ NC โดยใช้น้ำยาเก่า กับ taq ใหม่
     - กลุ่มที่ 4 ทำ PC และ NC โดยใช้น้ำยาเก่า กับ taq เก่า
     ผลปรากฎว่าเมื่อใช้ taq ใหม่ที่ได้จากห้องม้อย ในหลอด NC ไม่พบ band ครับ ในขณะที่ถ้าใช้ taq เก่าที่ใช้ในห้องผม ในหลอด NC ยังมี band ขึ้นอยู่  สรุปได้แล้วว่า หลอดที่ con เป็น taq ครับ ทั้งๆ ที่เพิ่งเอามาใช้ได้ราว 4-5 วัน จบกันเสียที กว่าจะหาเจอหมดไปอาทิตย์กว่าๆนับตั้งแต่เจจอปัญหา
      หลังจากนั้นก็เลยเอา sample มาลองทำ 16 ราย คาดหวังไว้เต็มที่บ่ายวันนี้จะได้จับลง sequencer เสียที แต่แม่เจ้าประคุณทูนหัว ผล PCR ออกมา NC มี band อีกแล้วครับท่าน แล้วมาจากไหนอีกล่ะ อาจจะไม่ con ในหลอดน้ำยาก็ได้ลอง repeat ดูอีกที แต่สวรรค์ไม่เป็นใจ ในหลอด NC ก็ยังมี band ตามมาหลอกหลอนอีกจนได้ สรุปได้ว่า con อีกแล้วครับท่าน แล้วทีนี้มาจากไหนอีกล่ะ
     ขอกลับไปคุมขมับก่อน นี่ก็ตีหนึ่งกว่าแล้ว พรุ่งนี้ค่อยว่ากันต่อ เจ้า mitocondria ตัวดี คิดจะลองของกับมือใหม่อย่างเรา ลองดูกันสักตั้งก็ได้ แล้วจะได้รู้ว่าใครเป็นใคร
หมายเหตุ เพื่อให้เข้าใจเรื่องนี้ง่ายขึ้น ผมขออธิบายเพิ่มเติมครับ ว่าในเซลล์ปกติของคนเราจะมี mitochondria อยู่แล้ว และมีปริมาณมากกว่า chromosome ประมาณ 1000 เท่า เพราะฉะนั้นจึงเป็นเรื่องที่ง่ายมากที่จะ contaminate ในการทำ PCR ของ mitochondria (เห็นไหมว่า หาแพะได้แล้ว)