ได้รับคำถามเกี่ยวกับ PCR ที่คิดว่า คงเป็นปัญหาที่หลายๆคนอาจจะพบเจอ และน่าจะนำมาแลกเปลี่ยนพูดคุยกันได้ทางบล็อกนี้ ก็เลยขอนำมาคั่นรายการ Basic Real-time PCR เสียก่อน เป็นปัญหาเกี่ยวกับ primer ที่มีใจความคำถามดังนี้ค่ะ
"อยากทราบว่าในการทำ PCR ปํญหาที่อาจเกิดขึ้นจะแก้อย่างไร เช่น ถ้า Forward and Reward Primer มีค่า Tm ต่างกัน จะทำอย่างไร อุณหภูมิของ step ที่3 (elongation)จะใช้เท่าไรดูจากตัวแปรไหนบ้างคะ อัตราการต่อสายหาได้ยังไงคะ และสุดท้ายวิธีลด non-specific band ทำอย่างไรได้บ้าง รบกวนช่วยตอบข้อสงสัยหน่อยนะคะ หรือช่วยแนะนำข้อมูลหรือหนังสือก็ได้ค่ะ"
จากประสบการณ์ของตัวเองพบว่า การทำ PCR นั้นเป็นวิธีการที่เรียกได้ว่าเป็นศิลปะอย่างหนึ่งทีเดียว ไม่มีคำตอบตายตัวใดๆ ทุกอย่างเป็น empirical process ทั้งนั้น และคนที่มีความคิดยืดหยุ่นโดยใช้หลักการพื้นฐานทางชีวเคมีจะสามารถแก้ปัญหาได้หลากหลายรูปแบบ ทฤษฎีมีไว้ช่วยในการคิดเท่านั้นเองค่ะ เพราะฉะนั้น สิ่งที่ต้องมีอย่างแรกก็คือ ความรู้พื้นฐานเกี่ยวกับส่วนประกอบต่างๆของ PCR ซึ่งจะหาอ่านได้หลากหลายที่มากๆค่ะ
สำหรับ 2-3 คำถามข้างบนนี้ มีความรู้พื้นฐานที่ใช้หาคำตอบได้ที่นี่ ( เป็นส่วนหนึ่งของ The Bio-Web ซึ่งเป็นเว็บไซต์ที่ Dr. Andrew Kropinski แห่ง Queen's University ของแคนาดาได้จัดทำขึ้นเพื่อเป็นวิทยาทาน เห็นว่าเป็นที่รวมของสิ่งที่มีประโยชน์มากๆค่ะ) เอาให้ตรงคำถามจริงๆ ก็คือ
- สำหรับคำถามแรก อยากให้ลองเข้าไปใช้โปรแกรม Primer3 ที่มีลิงค์จากเว็บไซต์นั้นแหละนะคะ ใส่ sequence ที่ต้องการ amplify เข้าไป พร้อมกับ primer ตัวใดตัวหนึ่ง (จะเป็น forward หรือ reverse ก็ได้ค่ะ) แล้วจะได้รับ primer ที่จะมาคู่กับตัวที่เราใส่เข้าไปหลายๆตัว ถ้าไม่มีตัวไหนเหมือนตัวที่เรามีเลย น่าจะแสดงว่าเราควรจะเปลี่ยน primer ค่ะ เพื่อให้ Tm ไปกันได้ ไม่ต่างกันมาก จากประสบการณ์ตรงของตัวเองนี่ บอกได้เลยว่า การตัดสินใจเปลี่ยน primer จะเสียเวลาและค่าใช้จ่ายน้อยกว่าการทนทู่ซี้ optimize primer set ที่ค่า Tm ไปด้วยกันไม่ได้นะคะ
- คำถามที่สอง ปกติถ้าใช้ Taq polymerase ก็จะเป็น 72 C อยู่แล้วค่ะ อุณหภูมิตรงนี้ก็จะขึ้นกับเอนไซม์ที่เราใช้ extend สาย nucleotide ของเรานั่นเองค่ะว่าเขาทำงานได้ดีที่อุณหภูมิเท่าไหร่ ต้องศึกษาจากคุณสมบัติของเขาทั้งอุณหภูมิและอัตราการต่อสายนะคะ
- ส่วนการลด non-specific band นั้นก็คือการ optimize reaction ของเรา ซึ่งอันนี้ก็จะต้องเริ่มจากการทดลองด้วยสภาวะพื้นฐานก่อน จะดูได้จากตารางที่มีส่วนประกอบของการทำ PCR จากลิงค์ที่ให้นี้ แล้วลอง run ดูก่อนที่จะปรับความเข้มข้นของส่วนประกอบต่างๆ สำหรับตัวเองจะเริ่มที่การปรับ Mg++ ค่ะ
หวังว่าจะมีท่านอื่นๆที่เคยพบปัญหานี้แล้วแก้ไขแบบอื่นๆ จะเข้ามาแลกเปลี่ยนประสบการณ์กันนะคะ ใครที่กำลัง optimize reaction อยู่อยากถามอะไรอื่นๆอีก ก็จะได้ใช้เป็นศูนย์กลางติดต่อกันได้ค่ะ
ผมขอข้อมูลเกี่ยวกับ การสร้าง pcr หน่อยได้ไหมคับ และก้อหลักการขอองมันอะคับ
ขอบคุณคับ
สวัสดีค่ะ
ขออนุญาตถามอาจารย์เกี่ยวกับเรื่อง SyBr green ในการทำ real time PCR ค่ะ เพราะว่าเจอปัญหาคือเมื่อใส่ SyBr green เข้าไปแล้วทำให้ reaction ไม่เกิด เหมือน SyBr green เป็นตัวไป inhibit ซึ่งจริงๆแล้วไม่น่าจะมีผลต่อ reaction ก็เลยเปลี่ยนความเข้มข้นของ SyBr green จาก 10X เป็น 1X (total volume 25 ul )ก็ดีขึ้นค่ะ reaction เกิดได้เหมือนเดิม แต่ peak ที่ได้ไม่สูงมาก และ ทำไมตำแหน่งของ peak ไม่เหมือนเดิม เมื่อทำ PCR ในครั้งถัดไป
รบกวนอาจารย์ช่วยตอบปัญหาด้วยนะคะ
ขอบพระคุณมากค่ะ
ขอบพระคุณอาจารย์มากนะคะ
หนูจะลองทำดูนะค่ะ
คำถามของน้อง Son กินพื้นที่ยาวมากค่ะ ขออนุญาตลบแล้วเอามาใส่ในคำตอบไปเลยนะคะ <div class="info">6. Son
เมื่อ ศ. 15 ก.พ. 2551 @ 18:01
547521 [ลบ]
</div><div class="content">
สวัสดีค่ะอาจารย์
หนูรบกวนถามอาจารย์ค่ะว่า หนูทำ real time PCR ได้ melt peak ที่ค่อนข้างห่างกัน โดยทำเป็นแบบแยกหลอดได้อุณหภูมิ ประมาณ 87 กับ 91 องศา แต่พอเอา primer ที่ใช้มารวมกัน ทำเป็น multiplex ทำให้ปฏิกิริยาไม่เกิด เห็นแต่ primer dimer หนูไม่ทราบว่าจะมีปัจจัยอะไรทำให้มีผลต่อปฏิกิริยา หนูเลยจะขอคำแนะนำสำหรับการทำ real time แบบ multiplex ค่ะ เพราะลองทำมาหลายครั้งแล้ว ก็ยังไม่ได้
ขอบพระคุณมากค่ะ
</div>
ขออธิบายคร่าวๆถึงสาเหตุที่น่าจะเป็นนะคะ
ข้อแรก การดู melt peak เป็นการดู PCR product ซึ่งอุณหภูมิที่มันแยกจากกันนั้นไม่เกี่ยวกับอุณหภูมิตอนทำ PCR นะคะ เพราะฉะนั้นไม่สามารถจะเอามาเป็นตัวบอกว่าเราจะสามารถทำ multiplex กับ products 2 ตัวนี้ได้ เพราะการจะทำ multiplex PCR ให้ได้ product 2 ตัวนั้นสิ่งที่ต้องคำนึงมากๆก็คือ primers คู่ที่ใช้น่ะค่ะ ถ้า sequence ของทั้ง 4 ตัวมีแนวโน้มจะ anneal กันเองมากกว่าจะไป anneal กับต้นแบบที่เราต้องการ amplify ก็จะเกิดปัญหาอย่างที่หนูพบนี่แหละค่ะ
หนูต้องไปเช็คดู primers ทั้ง 2 คู่ของหนูด้วยโปรแกรมเช่น Primer3 (free on web หาจากพี่ Google ได้ค่ะ) ถ้าหากว่าพอใส่ทั้ง 2 sets เป็น multiplex แล้วได้แต่ primer dimer ก็มีแนวโน้มว่า เจ้า primers ทั้ง 4 ชิ้นของหนู เขาชอบเกาะกันเองมากกว่าจะไปทำหน้าที่ต่อสายเจ้า product ที่เราต้องการจริงๆ น่าจะต้อง design primers ใหม่นะคะ แล้วก็ตรวจสอบจากโปรแกรมต่างๆที่ใช้ในการ design primers นี่แหละค่ะว่า sequence ของ primers จำเพาะกับ template มากกว่า คู่ primers ที่เราจะใส่มันลงไปพร้อมกัน ไม่ง่าย แต่ไม่ยากนะคะ ได้ผลยังไงเขียนมาคุยกันใหม่ได้นะคะ
สวัสดีค่ะอาจารย์
หนูมีปัญหารบกวนถามอาจารย์อีกแล้วค่ะว่าหนูใช้ primer set ทำแบบ multiplex โดยทำแบบ conventional ซึ่งก็ได้ band ที่ดี แต่พอนำ primer set นี้มาทำเป็น multiplex เหมือนกันแต่เป็นแบบ real time กลับมี reaction ที่ไม่ดี ลองปรับ MgCl แล้วก็ไม่ดีขึ้น ไม่ทราบว่าจะต้องแก้ปัญหาอย่างไร จะต้องเปลี่ยน primer ใหม่หรือไม่ และอยากทราบว่าเราจะใช้ gene อะไรเป็น internal control ในการทำ real time ได้บ้างค่ะ
เรื่อง multiplex PCR ในเครื่อง real time นี่คงจะยิ่งซับซ้อนกว่าในเครื่องแบบ conventional นะคะ พี่โอ๋ยังไม่เคยลงมือทำเองเลย เท่าที่จำได้รู้สึกว่าเคยแนะนำคนที่จะลองให้เอา PCR product ที่ได้จากวิธีธรรมดาใส่ SYRBG ลงไปแล้วลองเอาไป run melting curve analysis ดูว่า product ที่ได้ใน reaction buffer ที่เราใช้มีลักษณะเหมือนกันหรือต่างกันยังไง ไม่ได้ติดตามผลค่ะ (ตั้งแต่ตอนอยู่ออสเตรเลียโน่น) แต่รู้สึกว่าเขาก็ทำได้ด้วย primer set ชุดเดิมที่ทำในเครื่องธรรมดานะคะ แค่ปรับ conditions เอาทั้ง Mg++ conc. และ annealing temp. น่ะค่ะ
ลองค้นดูใน internet พบว่ามีโปรแกรมที่ design primers สำหรับ multiplex PCR หลายที่ ชิ้นนี้ฟรีที่ http://www.zaik.uni-koeln.de/AFS/Projects/Bioinformatics/mpxprimer.html
ลองเข้าไปดูแล้ว เช็คว่า primers และ condition ที่เราใช้นั้น โปรแกรมเขาบอกว่ายังไง ต้องปรับเปลี่ยนอะไร
คิดว่าถ้า work ในเรื่องธรรมดา น่าจะพอปรับให้ run ด้วย real-time ได้นะคะ คงไม่ถึงกับต้อง design primer ชุดใหม่ ขอให้โชคดีทำสำเร็จนะคะ
ลืมตอบเรื่อง internal control ไปค่ะ จะใช้ก็เมื่อต้องการทำ quantification ค่ะ ใช่ที่ต้องการหรือเปล่าคะ เพราะถ้าเราจะวัดปริมาณของ gene อะไร เราก็ต้องวัด gene อื่นๆที่เรารู้ว่ามีคงที่ในระบบนั้นๆ การเลือกตัวไหนก็เลยจะขึ้นอยู่กับว่าหนูทำการทดลองระบบอะไรน่ะค่ะ เช่นถ้าเป็น human blood ก็ใช้ beta-actin หรือ GAPDH บาง paper เขาก็แนะนำให้ใช้ 18S RNA แต่ถ้าไม่ใช่วัดปริมาณก็ไม่จำเป็นต้องมี internal control หรอกค่ะ ขอให้หนูโชคดีนะคะ
ขอบคุณอาจารย์มากๆค่ะ หนูจะลองไปศึกษาเพิ่มเติมดูค่ะ
อยากสอบถามเกี่ยวกับการamp pcrค่ะ คือหนูextract dna แล้วcheck product ทั้งหมด10 รายมีครบ แต่ทำไมเวลาทำpcr แล้วปรากฏว่ามันมีband แค่ 2 รายแต่อีก 8รายไม่ขึ้น band เลยทั้งๆที่ทำพร้อมกันเหมือนกันเลย
ส่วน primer dimer ก็เยอะมาก(อยากรู้วิธีคำนวณ condition) และลองทั้งเพิ่มปริมาณdna และ dilute dna แล้วค่ะก็ยังไม่ขึ้น รบกวนไขปัญหาด้วยค่ะ
สำหรับคำถามของคุณ pookpic นั้น พี่โอ๋อยากให้ลองเริ่มจากการวัดความเข้มข้นของ DNA ที่ extract มาได้ดูก่อนนะคะ เพราะถ้าทำ PCR เหมือนกันในชุดเดียวกัน (หมายถึงใช้ mastermix เดียวกัน) แล้วได้ product จากแค่ 2 รายอีก 8 ไม่ขึ้น ก็อาจจะเป็นเพราะจุดเริ่มต้นต่างกันได้ด้วยเหมือนกัน
แต่ถ้าบอกว่า primer dimer เยอะมากด้วยก็น่าจะเป็นเพราะ condition ที่ใช้ยังไม่ optimum ซึ่งก็จะอธิบายได้ด้วยว่าทำไมจึงไม่ได้ product ทุกราย ถ้าเป็นแบบนี้ก็ต้องลอง optimise ดูใหม่ด้วยการปรับเปลี่ยนความเข้มข้นของ Mg++, annealing temperature
สำหรับการคำนวณ condition นั้นเราทำเองยากค่ะ เพราะมีหลายปัจจัยที่เกี่ยวข้องในการคำนวณ เพราะเดี๋ยวนี้เขาสามารถจะ simulate reaction จาก primer sequence ได้ด้วยคอมพิวเตอร์กันแล้วค่ะ มี free software มากมายให้เลือกใช้นะคะ ลองเช็ค primer ที่ใช้อยู่กับโปรแกรมพวกนั้นดูก็ได้ค่ะ (ลองอ่านบันทึกนี้ตั้งแต่ต้น แล้วก็ตามลิงค์ไปอ่านรายละเอียดดูนะคะ คงจะช่วยให้คิดหาวิธีแก้ปัญหาได้มากขึ้น)
ได้แก้ปัญหาเยอะๆแบบนี้ถือเป็นโชคดีนะคะ ได้เรียนรู้วิธีการลองผิดลองถูกด้วย พี่โอ๋ว่า PCR นี่เป็นทั้งศาสตร์และศิลป์จริงๆค่ะ ขอให้โชคดีนะคะ
สวัสดีค่ะ
หายไปนานเลย หนูมีเรื่องจะรบกวนถามอาจารย์อีกแล้วค่ะ
หนูทำ real time มีขนาด fragment ค่อนข้างใหญ่คือ 1.7 กับ 1.5 kb ซึ่งหนูลองใช้ PCR product จากการทำ conventional PCR มาลองทำดูเพื่อหาตำแหน่ง melting curve ของ peak ในการ amp product ขนาด 1.7 kb ซึ่งเมื่อนำมา run gel ก็พบ band ตามที่ต้องการ พอดู peak ก็ได้ตำแหน่ง ประมาณ 76 องศา ก็เลยลง real time โดยใช้ PCR product พร้อมกับ genomic DNA เที่ยบกัน โดยใช้สี Syto 9 green พอทำออกมาแล้วพบว่่าในตัวอย่างที่เป็น genomic DNA กลับ amplified ไม่ได้ ซึ่งหนูก็ลองเพิ่ม additive , enzyme แล้วก็ไม่ได้ช่วยอะไร หนูควรจะแก้ปัญหานี้อย่างไรดีค่ะ
ขอบคุณค่ะ
หนู son คะ ต้องขอบอกว่าไม่ค่อยแน่ใจว่าเข้าใจคำถามหนูถูกไหมนะคะ ขอให้หนูช่วยเขียนขั้นตอนการทดลองของหนูตามลำดับที่ทำจริงๆให้ละเอียดขึ้นอีกนิดนะคะ อ่านแล้วยังค่อนข้าง งง อยู่ค่ะ
- หนูใช้ sample ที่เป็น PCR product จากการทำ conventional PCR มาลองทำ real time เพื่อหาตำแหน่งของ melt peak ซึ่งหนูทำ real time โดยมีขนาด fragment 1.7 kb ใช้สี Syto 9 green
- พบ peak ที่ประมาณ 76 องศาโดยพบทั้งในราย positive และ negative ซึ่งจริงๆแล้วมันควรจะขึ้นแต่ในรายที่ positive เพราะ band ที่ได้จากการ run gel ก็เป็น positive band แสดงว่ามันยังไม่ specific ใช่มั้ยค่ะ (ในราย positive melt peak สูงมาก)
- ทำ real time โดยใช้ sample tube หนึ่งเป็น PCR product อีก tube เป็น genomic DNA ผลออกมาพบว่า amplified ได้เฉพาะใน sample ที่เป็น PCR product หนูจึงอยากทราบว่าจะมีวิธีอะไรที่จะช่วยให้ amplified fragment ขนาดใหญ่ในการทำ real time PCR
ถ้าเห็น peak ทั้งในราย neg และ pos แล้วแถมมี melting temperature แค่ 76 นี่น่าจะไม่ใช่ product ที่เราตรวจสอบใน gel นะคะ เพราะพวกที่เป็น product จริงๆน่าจะมี melt peak ที่อุณหภูมิสูงกว่านี้ค่ะ (น่าจะเกิน 80 องศาขึ้นไปน่ะค่ะ)
เพราะฉะนั้น product ที่เราเห็นว่า amp ได้นี่อาจจะไม่ใช่ที่เราต้องการก็ได้นะคะ เพียงแต่จาก PCR product นั้นตัวมันเองมีการ incoporate dye เข้าไปให้เรา detect ได้ด้วยเครื่องเท่านั้นเอง
พี่โอ๋ลอง search ดูคร่าวๆพบว่า product ขนาดยักษ์ๆที่ใช้ real-time PCR method ทำก็พอมีนะคะ อย่างที่ http://www.epibio.com/pdfforum/11_4_17-19.pdf เขาได้ product 1.3 kb แต่เห็นมีปัญหาว่า ต้อง titrate หาความเข้มข้น template กับปรับ cycling time
ปกติเขาแนะนำ product size ที่เหมาะกับการใช้ real-time PCR ไว้ไม่เกิน 4-500 bp น่ะค่ะ ก็เลยไม่แน่ใจว่าจะ work ไหมกับ product ใหญ่ขนาดนี้
หนูอาจจะต้องปรับ condition ให้ได้ product จริงๆหลายรอบหน่อยนะคะ ไว้พี่โอ๋หาแหล่งที่จะถามเรื่องนี้ได้แล้วจะมาบอกเพิ่มเติมนะคะ ปัญหานี้น่าจะต้องถามพวก forum ต่างๆที่เขาทำ real-time ดูค่ะ พี่โอ๋ห่างหายจากวงการเขามานาน สงสัยต้องใช้เวลาตามหากันหน่อยนะคะ
ขอบคุณมากนะคะที่ช่วยหาข้อมูลให้
พอดีหนูลองใช้ condition นี้ในการทำ conventional PCR แล้วมัน amplified ได้ดี ก็เลยลองเอามาทำ real time PCR ซึ่งพอทำแล้วกลับไม่ได้ผลดีเหมือนทำในconventional PCR หนูก็เลยลองปรับหลายอย่างแต่มันก็ไม่ได้ผล แต่เดี๋ยวคงจะต้องไปลองปรับเหมือนที่อาจารย์บอกคะ
อยากสอบถามนิดนึงค่ะ คือว่าทำ PCR แล้วพอนำ pcr product มารัน agarose gel ดูพบว่าเกิด เป็น smear ค่ะ แต่ว่าพบ single band ที่ตรงกับ size ยีนที่ต้องการ นะคะ แล้วก็มี primer dimer ค่อนข้างเยอะค่ะ ลองนำ template มาเช็คดูแล้วยังใช้ได้ค่ะ จะแก้ไขปัญหายังไงดีคะ หรือว่าสภาวะยังไม่เหมาะสม ขอบคุณล่วงหน้าค่ะ
ปัญหาแบบนี้มีคนเจอเหมือนกันค่ะ ลองอ่านดูที่นี่นะคะ มีคนแก้หลายแบบค่ะ อ่านดูว่าอันไหนเข้าเค้ากับของเราก็ลองปรับดูนะคะ เป็น forum ที่เขาเอาปัญหาการทำ PCR มาแลกเปลี่ยนบอกเล่ากันน่ะค่ะ