ติดต่อ

  ติดต่อ

ปัญหาของ PCR...คำถามที่น่าจะเอามาแลกเปลี่ยนกัน

  เป็นปัญหาที่คำตอบจากประสบการณ์...คือสิ่งที่ดีที่สุดค่ะ  

ได้รับคำถามเกี่ยวกับ PCR ที่คิดว่า คงเป็นปัญหาที่หลายๆคนอาจจะพบเจอ และน่าจะนำมาแลกเปลี่ยนพูดคุยกันได้ทางบล็อกนี้ ก็เลยขอนำมาคั่นรายการ Basic Real-time PCR เสียก่อน เป็นปัญหาเกี่ยวกับ primer ที่มีใจความคำถามดังนี้ค่ะ

"อยากทราบว่าในการทำ PCR ปํญหาที่อาจเกิดขึ้นจะแก้อย่างไร เช่น ถ้า Forward and Reward Primer มีค่า Tm ต่างกัน จะทำอย่างไร  อุณหภูมิของ step ที่3 (elongation)จะใช้เท่าไรดูจากตัวแปรไหนบ้างคะ  อัตราการต่อสายหาได้ยังไงคะ และสุดท้ายวิธีลด non-specific band ทำอย่างไรได้บ้าง รบกวนช่วยตอบข้อสงสัยหน่อยนะคะ หรือช่วยแนะนำข้อมูลหรือหนังสือก็ได้ค่ะ"

จากประสบการณ์ของตัวเองพบว่า การทำ PCR นั้นเป็นวิธีการที่เรียกได้ว่าเป็นศิลปะอย่างหนึ่งทีเดียว ไม่มีคำตอบตายตัวใดๆ ทุกอย่างเป็น empirical process ทั้งนั้น และคนที่มีความคิดยืดหยุ่นโดยใช้หลักการพื้นฐานทางชีวเคมีจะสามารถแก้ปัญหาได้หลากหลายรูปแบบ ทฤษฎีมีไว้ช่วยในการคิดเท่านั้นเองค่ะ เพราะฉะนั้น สิ่งที่ต้องมีอย่างแรกก็คือ ความรู้พื้นฐานเกี่ยวกับส่วนประกอบต่างๆของ PCR ซึ่งจะหาอ่านได้หลากหลายที่มากๆค่ะ

สำหรับ 2-3 คำถามข้างบนนี้ มีความรู้พื้นฐานที่ใช้หาคำตอบได้ที่นี่ ( เป็นส่วนหนึ่งของ The Bio-Web ซึ่งเป็นเว็บไซต์ที่ Dr. Andrew Kropinski แห่ง Queen's University ของแคนาดาได้จัดทำขึ้นเพื่อเป็นวิทยาทาน เห็นว่าเป็นที่รวมของสิ่งที่มีประโยชน์มากๆค่ะ) เอาให้ตรงคำถามจริงๆ ก็คือ

  • สำหรับคำถามแรก อยากให้ลองเข้าไปใช้โปรแกรม Primer3 ที่มีลิงค์จากเว็บไซต์นั้นแหละนะคะ ใส่ sequence ที่ต้องการ amplify เข้าไป พร้อมกับ primer ตัวใดตัวหนึ่ง (จะเป็น forward หรือ reverse ก็ได้ค่ะ) แล้วจะได้รับ primer ที่จะมาคู่กับตัวที่เราใส่เข้าไปหลายๆตัว ถ้าไม่มีตัวไหนเหมือนตัวที่เรามีเลย น่าจะแสดงว่าเราควรจะเปลี่ยน primer ค่ะ เพื่อให้ Tm ไปกันได้ ไม่ต่างกันมาก จากประสบการณ์ตรงของตัวเองนี่ บอกได้เลยว่า การตัดสินใจเปลี่ยน primer จะเสียเวลาและค่าใช้จ่ายน้อยกว่าการทนทู่ซี้ optimize primer set ที่ค่า Tm ไปด้วยกันไม่ได้นะคะ
  • คำถามที่สอง ปกติถ้าใช้ Taq polymerase ก็จะเป็น 72 C อยู่แล้วค่ะ อุณหภูมิตรงนี้ก็จะขึ้นกับเอนไซม์ที่เราใช้ extend สาย nucleotide ของเรานั่นเองค่ะว่าเขาทำงานได้ดีที่อุณหภูมิเท่าไหร่ ต้องศึกษาจากคุณสมบัติของเขาทั้งอุณหภูมิและอัตราการต่อสายนะคะ
  • ส่วนการลด non-specific band นั้นก็คือการ optimize reaction ของเรา ซึ่งอันนี้ก็จะต้องเริ่มจากการทดลองด้วยสภาวะพื้นฐานก่อน จะดูได้จากตารางที่มีส่วนประกอบของการทำ PCR จากลิงค์ที่ให้นี้ แล้วลอง run ดูก่อนที่จะปรับความเข้มข้นของส่วนประกอบต่างๆ สำหรับตัวเองจะเริ่มที่การปรับ Mg++ ค่ะ   

หวังว่าจะมีท่านอื่นๆที่เคยพบปัญหานี้แล้วแก้ไขแบบอื่นๆ จะเข้ามาแลกเปลี่ยนประสบการณ์กันนะคะ ใครที่กำลัง optimize reaction อยู่อยากถามอะไรอื่นๆอีก ก็จะได้ใช้เป็นศูนย์กลางติดต่อกันได้ค่ะ

บันทึกนี้เขียนที่ GotoKnow โดย 

หมายเลขบันทึก: 115585, เขียน: , แก้ไข, , สัญญาอนุญาต: สงวนสิทธิ์ทุกประการ, ดอกไม้: 8, ความเห็น: 134, อ่าน: คลิก

ความเห็น (34)

  รายการนี้มีมากกว่า 100 ความเห็น
kook
IP: xxx.246.45.240
เขียนเมื่อ 

ผมขอข้อมูลเกี่ยวกับ การสร้าง pcr หน่อยได้ไหมคับ และก้อหลักการขอองมันอะคับ

ขอบคุณคับ

คุณ  kook ลองตามลิงค์ในบันทึกข้างบนไปนะคะจะได้คำตอบค่ะ
son
IP: xxx.7.137.229
เขียนเมื่อ 

สวัสดีค่ะ

ขออนุญาตถามอาจารย์เกี่ยวกับเรื่อง SyBr green ในการทำ real time PCR ค่ะ เพราะว่าเจอปัญหาคือเมื่อใส่  SyBr green เข้าไปแล้วทำให้  reaction ไม่เกิด เหมือน SyBr green เป็นตัวไป inhibit ซึ่งจริงๆแล้วไม่น่าจะมีผลต่อ reaction ก็เลยเปลี่ยนความเข้มข้นของ SyBr green จาก 10X เป็น 1X  (total volume 25 ul )ก็ดีขึ้นค่ะ reaction เกิดได้เหมือนเดิม แต่ peak ที่ได้ไม่สูงมาก และ ทำไมตำแหน่งของ peak ไม่เหมือนเดิม เมื่อทำ PCR ในครั้งถัดไป

รบกวนอาจารย์ช่วยตอบปัญหาด้วยนะคะ

ขอบพระคุณมากค่ะ 

ปกติเวลาทำ real-time PCR ที่ใส่ SYBr green เราต้องเพิ่มความเข้มข้นของ Mg++ ค่ะ ทำให้ใช้ในช่วงที่ค่อนข้างสูงกว่าใน PCR ธรรมดา ต้องลอง optimise ดูว่าควรใช้เท่าไหร่ จึงจะได้ reaction curve ที่เหมาะสมนะคะ (จาก 1.5 mM ถึง 4 mM น่ะค่ะ) และควรจะใช้ 1x SYBr green เท่านั้นค่ะ และถ้าจะให้ดีก็ควรจะ aliquot ไว้เป็น 5x  เยอะหน่อยแล้วเอามา dilute ตอนทำจะช่วยลด variation ของ peak ได้ค่ะ หนูหมายถึง peak ของ melting curve ใช่ไหมคะ เพราะอุณหภูมินี้จะขึ้นกับ solution ที่ PCR product เขาอยู่ ถ้าเรา vary อะไรไปนิดเดียวเขาก็เปลี่ยนได้บ้างค่ะ ทำให้ต้องควบคุมการใช้ pipette ให้แม่นยำมากๆ สำหรับ real-time PCR เพราะ volume ที่ใช้ก็น้อยมากอยู่แล้วนะคะ ถ้าไม่เชี่ยวชาญชำนาญจริงๆควรจะใช้ kits ที่เขาผสมSYBr green เป็น master mixs มาให้แล้วจะได้ผลแม่นยำและ comparable กว่าด้วยค่ะ
son
IP: xxx.7.139.47
เขียนเมื่อ 

ขอบพระคุณอาจารย์มากนะคะ

หนูจะลองทำดูนะค่ะ 

คำถามของน้อง Son กินพื้นที่ยาวมากค่ะ ขออนุญาตลบแล้วเอามาใส่ในคำตอบไปเลยนะคะ  
6. Son
เมื่อ ศ. 15 ก.พ. 2551 @ 18:01
547521 [ลบ]

สวัสดีค่ะอาจารย์

หนูรบกวนถามอาจารย์ค่ะว่า หนูทำ real time PCR ได้ melt peak ที่ค่อนข้างห่างกัน โดยทำเป็นแบบแยกหลอดได้อุณหภูมิ ประมาณ 87 กับ 91 องศา แต่พอเอา primer ที่ใช้มารวมกัน ทำเป็น multiplex ทำให้ปฏิกิริยาไม่เกิด เห็นแต่ primer dimer หนูไม่ทราบว่าจะมีปัจจัยอะไรทำให้มีผลต่อปฏิกิริยา หนูเลยจะขอคำแนะนำสำหรับการทำ real time แบบ multiplex ค่ะ เพราะลองทำมาหลายครั้งแล้ว ก็ยังไม่ได้

ขอบพระคุณมากค่ะ

ขออธิบายคร่าวๆถึงสาเหตุที่น่าจะเป็นนะคะ

ข้อแรก การดู melt peak เป็นการดู PCR product ซึ่งอุณหภูมิที่มันแยกจากกันนั้นไม่เกี่ยวกับอุณหภูมิตอนทำ PCR นะคะ เพราะฉะนั้นไม่สามารถจะเอามาเป็นตัวบอกว่าเราจะสามารถทำ multiplex กับ products 2 ตัวนี้ได้ เพราะการจะทำ multiplex PCR ให้ได้ product 2 ตัวนั้นสิ่งที่ต้องคำนึงมากๆก็คือ primers คู่ที่ใช้น่ะค่ะ ถ้า sequence ของทั้ง 4 ตัวมีแนวโน้มจะ anneal กันเองมากกว่าจะไป anneal กับต้นแบบที่เราต้องการ amplify ก็จะเกิดปัญหาอย่างที่หนูพบนี่แหละค่ะ

หนูต้องไปเช็คดู primers ทั้ง 2 คู่ของหนูด้วยโปรแกรมเช่น Primer3 (free on web หาจากพี่ Google ได้ค่ะ) ถ้าหากว่าพอใส่ทั้ง 2 sets เป็น multiplex แล้วได้แต่ primer dimer ก็มีแนวโน้มว่า เจ้า primers ทั้ง 4 ชิ้นของหนู เขาชอบเกาะกันเองมากกว่าจะไปทำหน้าที่ต่อสายเจ้า product ที่เราต้องการจริงๆ น่าจะต้อง design primers ใหม่นะคะ แล้วก็ตรวจสอบจากโปรแกรมต่างๆที่ใช้ในการ design primers นี่แหละค่ะว่า sequence ของ primers จำเพาะกับ template มากกว่า คู่ primers ที่เราจะใส่มันลงไปพร้อมกัน ไม่ง่าย แต่ไม่ยากนะคะ ได้ผลยังไงเขียนมาคุยกันใหม่ได้นะคะ

son
IP: xxx.12.97.116
เขียนเมื่อ 

สวัสดีค่ะอาจารย์

    หนูมีปัญหารบกวนถามอาจารย์อีกแล้วค่ะว่าหนูใช้ primer set ทำแบบ multiplex โดยทำแบบ conventional ซึ่งก็ได้ band ที่ดี แต่พอนำ primer set นี้มาทำเป็น multiplex เหมือนกันแต่เป็นแบบ real time กลับมี reaction ที่ไม่ดี ลองปรับ MgCl แล้วก็ไม่ดีขึ้น ไม่ทราบว่าจะต้องแก้ปัญหาอย่างไร จะต้องเปลี่ยน primer ใหม่หรือไม่ และอยากทราบว่าเราจะใช้ gene อะไรเป็น internal control ในการทำ real time ได้บ้างค่ะ

เรื่อง multiplex PCR ในเครื่อง real time นี่คงจะยิ่งซับซ้อนกว่าในเครื่องแบบ conventional นะคะ พี่โอ๋ยังไม่เคยลงมือทำเองเลย เท่าที่จำได้รู้สึกว่าเคยแนะนำคนที่จะลองให้เอา PCR product ที่ได้จากวิธีธรรมดาใส่ SYRBG ลงไปแล้วลองเอาไป run melting curve analysis ดูว่า product ที่ได้ใน reaction buffer ที่เราใช้มีลักษณะเหมือนกันหรือต่างกันยังไง ไม่ได้ติดตามผลค่ะ (ตั้งแต่ตอนอยู่ออสเตรเลียโน่น) แต่รู้สึกว่าเขาก็ทำได้ด้วย primer set ชุดเดิมที่ทำในเครื่องธรรมดานะคะ แค่ปรับ conditions เอาทั้ง Mg++ conc. และ annealing temp. น่ะค่ะ

ลองค้นดูใน internet พบว่ามีโปรแกรมที่ design primers สำหรับ multiplex PCR หลายที่ ชิ้นนี้ฟรีที่ http://www.zaik.uni-koeln.de/AFS/Projects/Bioinformatics/mpxprimer.html

ลองเข้าไปดูแล้ว เช็คว่า primers และ condition ที่เราใช้นั้น โปรแกรมเขาบอกว่ายังไง ต้องปรับเปลี่ยนอะไร

คิดว่าถ้า work ในเรื่องธรรมดา น่าจะพอปรับให้ run ด้วย real-time ได้นะคะ คงไม่ถึงกับต้อง design primer ชุดใหม่ ขอให้โชคดีทำสำเร็จนะคะ

โอ๋-อโณ
IP: xxx.12.73.8
เขียนเมื่อ 

ลืมตอบเรื่อง internal control ไปค่ะ จะใช้ก็เมื่อต้องการทำ quantification ค่ะ ใช่ที่ต้องการหรือเปล่าคะ เพราะถ้าเราจะวัดปริมาณของ gene อะไร เราก็ต้องวัด gene อื่นๆที่เรารู้ว่ามีคงที่ในระบบนั้นๆ การเลือกตัวไหนก็เลยจะขึ้นอยู่กับว่าหนูทำการทดลองระบบอะไรน่ะค่ะ เช่นถ้าเป็น human blood ก็ใช้ beta-actin หรือ GAPDH บาง paper เขาก็แนะนำให้ใช้ 18S RNA แต่ถ้าไม่ใช่วัดปริมาณก็ไม่จำเป็นต้องมี internal control หรอกค่ะ ขอให้หนูโชคดีนะคะ

son
IP: xxx.7.137.6
เขียนเมื่อ 

ขอบคุณอาจารย์มากๆค่ะ หนูจะลองไปศึกษาเพิ่มเติมดูค่ะ

pookpic
IP: xxx.9.163.247
เขียนเมื่อ 

อยากสอบถามเกี่ยวกับการamp pcrค่ะ คือหนูextract dna แล้วcheck product ทั้งหมด10 รายมีครบ แต่ทำไมเวลาทำpcr แล้วปรากฏว่ามันมีband แค่ 2 รายแต่อีก 8รายไม่ขึ้น band เลยทั้งๆที่ทำพร้อมกันเหมือนกันเลย

ส่วน primer dimer ก็เยอะมาก(อยากรู้วิธีคำนวณ condition) และลองทั้งเพิ่มปริมาณdna และ dilute dna แล้วค่ะก็ยังไม่ขึ้น รบกวนไขปัญหาด้วยค่ะ

สำหรับคำถามของคุณ pookpic นั้น พี่โอ๋อยากให้ลองเริ่มจากการวัดความเข้มข้นของ DNA ที่ extract มาได้ดูก่อนนะคะ เพราะถ้าทำ PCR เหมือนกันในชุดเดียวกัน (หมายถึงใช้ mastermix เดียวกัน) แล้วได้ product จากแค่ 2 รายอีก 8 ไม่ขึ้น ก็อาจจะเป็นเพราะจุดเริ่มต้นต่างกันได้ด้วยเหมือนกัน

แต่ถ้าบอกว่า primer dimer เยอะมากด้วยก็น่าจะเป็นเพราะ condition ที่ใช้ยังไม่ optimum ซึ่งก็จะอธิบายได้ด้วยว่าทำไมจึงไม่ได้ product ทุกราย ถ้าเป็นแบบนี้ก็ต้องลอง optimise ดูใหม่ด้วยการปรับเปลี่ยนความเข้มข้นของ Mg++, annealing temperature

สำหรับการคำนวณ condition นั้นเราทำเองยากค่ะ เพราะมีหลายปัจจัยที่เกี่ยวข้องในการคำนวณ เพราะเดี๋ยวนี้เขาสามารถจะ simulate reaction จาก primer sequence ได้ด้วยคอมพิวเตอร์กันแล้วค่ะ มี free software มากมายให้เลือกใช้นะคะ ลองเช็ค primer ที่ใช้อยู่กับโปรแกรมพวกนั้นดูก็ได้ค่ะ (ลองอ่านบันทึกนี้ตั้งแต่ต้น แล้วก็ตามลิงค์ไปอ่านรายละเอียดดูนะคะ คงจะช่วยให้คิดหาวิธีแก้ปัญหาได้มากขึ้น)

ได้แก้ปัญหาเยอะๆแบบนี้ถือเป็นโชคดีนะคะ ได้เรียนรู้วิธีการลองผิดลองถูกด้วย  พี่โอ๋ว่า PCR นี่เป็นทั้งศาสตร์และศิลป์จริงๆค่ะ ขอให้โชคดีนะคะ

son
IP: xxx.42.82.139
เขียนเมื่อ 

สวัสดีค่ะ

หายไปนานเลย หนูมีเรื่องจะรบกวนถามอาจารย์อีกแล้วค่ะ

หนูทำ real time มีขนาด fragment ค่อนข้างใหญ่คือ 1.7 กับ 1.5 kb ซึ่งหนูลองใช้ PCR product จากการทำ conventional PCR มาลองทำดูเพื่อหาตำแหน่ง melting curve ของ peak ในการ amp product ขนาด 1.7 kb ซึ่งเมื่อนำมา run gel ก็พบ band ตามที่ต้องการ พอดู peak ก็ได้ตำแหน่ง ประมาณ 76 องศา ก็เลยลง real time โดยใช้ PCR product พร้อมกับ genomic DNA เที่ยบกัน โดยใช้สี Syto 9 green พอทำออกมาแล้วพบว่่าในตัวอย่างที่เป็น genomic DNA กลับ amplified ไม่ได้ ซึ่งหนูก็ลองเพิ่ม additive , enzyme แล้วก็ไม่ได้ช่วยอะไร หนูควรจะแก้ปัญหานี้อย่างไรดีค่ะ

ขอบคุณค่ะ

หนู son คะ ต้องขอบอกว่าไม่ค่อยแน่ใจว่าเข้าใจคำถามหนูถูกไหมนะคะ ขอให้หนูช่วยเขียนขั้นตอนการทดลองของหนูตามลำดับที่ทำจริงๆให้ละเอียดขึ้นอีกนิดนะคะ อ่านแล้วยังค่อนข้าง งง อยู่ค่ะ

son
IP: xxx.7.138.27
เขียนเมื่อ 

- หนูใช้ sample ที่เป็น PCR product จากการทำ conventional PCR มาลองทำ real time เพื่อหาตำแหน่งของ melt peak ซึ่งหนูทำ real time โดยมีขนาด fragment 1.7 kb ใช้สี Syto 9 green

- พบ peak ที่ประมาณ 76 องศาโดยพบทั้งในราย positive และ negative ซึ่งจริงๆแล้วมันควรจะขึ้นแต่ในรายที่ positive เพราะ band ที่ได้จากการ run gel ก็เป็น positive band แสดงว่ามันยังไม่ specific ใช่มั้ยค่ะ (ในราย positive melt peak สูงมาก)

- ทำ real time โดยใช้ sample tube หนึ่งเป็น PCR product อีก tube เป็น genomic DNA ผลออกมาพบว่า amplified ได้เฉพาะใน sample ที่เป็น PCR product หนูจึงอยากทราบว่าจะมีวิธีอะไรที่จะช่วยให้ amplified fragment ขนาดใหญ่ในการทำ real time PCR

ถ้าเห็น peak ทั้งในราย neg และ pos แล้วแถมมี melting temperature แค่ 76 นี่น่าจะไม่ใช่ product ที่เราตรวจสอบใน gel นะคะ เพราะพวกที่เป็น product จริงๆน่าจะมี melt peak ที่อุณหภูมิสูงกว่านี้ค่ะ (น่าจะเกิน 80 องศาขึ้นไปน่ะค่ะ)

เพราะฉะนั้น product ที่เราเห็นว่า amp ได้นี่อาจจะไม่ใช่ที่เราต้องการก็ได้นะคะ เพียงแต่จาก PCR product นั้นตัวมันเองมีการ incoporate dye เข้าไปให้เรา detect ได้ด้วยเครื่องเท่านั้นเอง

พี่โอ๋ลอง search ดูคร่าวๆพบว่า product ขนาดยักษ์ๆที่ใช้ real-time PCR method ทำก็พอมีนะคะ อย่างที่ http://www.epibio.com/pdfforum/11_4_17-19.pdf เขาได้ product 1.3 kb แต่เห็นมีปัญหาว่า ต้อง titrate หาความเข้มข้น template กับปรับ cycling time

ปกติเขาแนะนำ product size ที่เหมาะกับการใช้ real-time PCR ไว้ไม่เกิน 4-500 bp น่ะค่ะ ก็เลยไม่แน่ใจว่าจะ work ไหมกับ product ใหญ่ขนาดนี้

หนูอาจจะต้องปรับ condition ให้ได้ product จริงๆหลายรอบหน่อยนะคะ ไว้พี่โอ๋หาแหล่งที่จะถามเรื่องนี้ได้แล้วจะมาบอกเพิ่มเติมนะคะ ปัญหานี้น่าจะต้องถามพวก forum ต่างๆที่เขาทำ real-time ดูค่ะ พี่โอ๋ห่างหายจากวงการเขามานาน สงสัยต้องใช้เวลาตามหากันหน่อยนะคะ

son
IP: xxx.12.97.100
เขียนเมื่อ 

ขอบคุณมากนะคะที่ช่วยหาข้อมูลให้

พอดีหนูลองใช้ condition นี้ในการทำ conventional PCR แล้วมัน amplified ได้ดี ก็เลยลองเอามาทำ real time PCR ซึ่งพอทำแล้วกลับไม่ได้ผลดีเหมือนทำในconventional PCR หนูก็เลยลองปรับหลายอย่างแต่มันก็ไม่ได้ผล แต่เดี๋ยวคงจะต้องไปลองปรับเหมือนที่อาจารย์บอกคะ

kaiau
IP: xxx.147.39.17
เขียนเมื่อ 

อยากสอบถามนิดนึงค่ะ คือว่าทำ PCR แล้วพอนำ pcr product มารัน agarose gel ดูพบว่าเกิด เป็น smear ค่ะ แต่ว่าพบ single band ที่ตรงกับ size ยีนที่ต้องการ นะคะ แล้วก็มี primer dimer ค่อนข้างเยอะค่ะ ลองนำ template มาเช็คดูแล้วยังใช้ได้ค่ะ จะแก้ไขปัญหายังไงดีคะ หรือว่าสภาวะยังไม่เหมาะสม ขอบคุณล่วงหน้าค่ะ

ปัญหาแบบนี้มีคนเจอเหมือนกันค่ะ ลองอ่านดูที่นี่นะคะ มีคนแก้หลายแบบค่ะ อ่านดูว่าอันไหนเข้าเค้ากับของเราก็ลองปรับดูนะคะ เป็น forum ที่เขาเอาปัญหาการทำ PCR มาแลกเปลี่ยนบอกเล่ากันน่ะค่ะ

palmolive
IP: xxx.157.232.6
เขียนเมื่อ 

คือหนุทำ pcr แยกแบคทีเรียจากฟองน้ำค่ะเมื่อผลออกมาไม่แน่ใจว่ามัน primer-dimer หรือป่าวอยากทราบว่า primer-dimer ที่เกิดขึ้นประมาณกี่ bp ค่ะ

แล้วจะแก้ปัญหานี้ได้อย่างไรค่ะ

และเป็นไปได้ไหมค่ะว่าแบคทีเรียที่ต่างชนิดกันที่มาจากฟองน้ำต่างชนิดและชนิดเดียวกันแล้วมีแบน pcr ขึ้นขนาดเดียวกันได้ค่ะ

som
IP: xxx.123.218.159
เขียนเมื่อ 

หนูสกัด RNA ด้วย trizol แล้วก็เปลี่ยนเป็น cDNA เพื่อไปทำ PCR หนูทำยีน beta actin แต่ทำแล้วบางทีก็ขึ้น บางทีก็ไม่ขึ้น เช่น ทำ 8 ตัวอย่าง ขึ้น 6 หาย 2 ทั้งที่แน่ใจว่าได้ใส่ template ไปแล้วแน่นอน ช่วยให้คำปรึกษาหนูหน่อยครับ

ตอบคำถามหนู palmolive [IP: 124.157.232.6] ก่อนนะคะ

หนูคงต้องเอา primers ของหนูเช็คที่ BLAST ว่า product ที่ได้เป็นแบคทีเรียที่หนูต้องการหรือเปล่าและมีขนาดเท่าไหร่บ้างก่อนนะคะ จากผลของ BLAST ก็จะได้ทราบว่ามี product อะไรอื่นๆที่อาจจะเป็น primer-dimer ได้ด้วยค่ะ พวกที่มีเปอร์เซ็นต์ similarity ต่ำๆน่ะค่ะ ก็พอดูได้ว่ามีขนาดสักเท่าไหร่บ้าง 

การแก้ปัญหา primer-dimer ก็ต้องทำการ optimize PCR reaction จนกว่าจะสามารถกำจัดมันได้น่ะค่ะ ทำได้หลายวิธี อาจจะลองเพิ่มลดอุณหภูมิที่ใช้ annealing, ปรับความเข้มข้นของ Mg, primers หรือ template ลองทีละอย่างไปเรื่อยๆจนกว่าจะได้เฉพาะ product ที่เราต้องการ

"แบคทีเรียที่ต่างชนิดกันที่มาจากฟองน้ำต่างชนิดและชนิดเดียวกันแล้วมีแบน pcr ขึ้นขนาดเดียวกัน" เป็นไปได้ค่ะ ตรวจสอบได้จากผล BLAST นั่นแหละนะคะ  

ส่วนคำถามของน้อง  som [IP: 222.123.218.159] นั้น เหตุผลที่อาจเป็นไปได้น่าจะอยู่ที่คุณภาพของ RNA ที่ได้จาก trizol  น่ะค่ะ ที่เคยทำจะใช้วิธี run RNA gel เช็คคุณภาพดูอีกทีก่อนค่ะ ซึ่งการที่เราต้อง amplify Beta actin เป็น control ก็เพราะอย่างนี้แหละค่ะ

som
IP: xxx.142.204.1
เขียนเมื่อ 

หนูเอา RNA ไปวัดความเข้มข้นก่อนจะเอามา แปลงเป็น cDNA แล้วนะคะ ซึ่งความเข้มข้นของ RNA ก็อยู่ในเกณฑ์ที่ยอมรับได้นะคะ และที่แบนไม่ขึ้นพี่คิดว่าเป็นเพราะ RNA ไม่ม่คุณภาพเหรอคะ

หนู som วัด RNA ด้วยวิธีไหนคะ ถ้าด้วยการวัด OD เฉยๆจะไม่สามารถบอกคุณภาพได้ค่ะ ได้แต่ปริมาณเท่านั้น และการสกัดด้วยวิธีของ Trizol อาจมี contaminate ที่ทำให้ได้ค่า OD260 สูงกว่าจริง (เหมือนว่ามี RNA มากแต่ที่จริงไม่ใช่) ได้ด้วยค่ะ การ run gel จะช่วยให้เราเห็นว่า RNA ที่ได้สมบูรณ์หรือ degrade ได้ด้วยค่ะ เพราะ RNA ที่มีปริมาณโอเคแต่ degrade ก็จะทำ RT แล้วได้ cDNA ที่ไม่สมบูรณ์ซึ่งทำให้เรา amplify beta actin ได้บ้างไม่ได้บ้างได้ค่ะ

IP: xxx.90.13.192
เขียนเมื่อ 

สวัสดีค่ะ อาจารย์

หนูกำลังแปลบทความภาษาอังกฤษเกี่ยวกับ Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR) และ (SON-PCR) Single oligonucleotide nested PCR แต่หนูมีความรู้แค่พื้นฐานPCRเท่านั้นเองค่ะ

หนูอยากรู้หลักการของPCRทั้งสองแบบและความแตกต่างจากPCRธรรมดาค่ะ

รบกวนอ.ด้วยนะค่ะ เพราะหนูลองหาเองแล้วยังไงก็ไม่เจอเลยค่ะ

IP: xxx.47.232.126
เขียนเมื่อ 

อาจารย์คะ หนูทำ PCR บนตำแหน่ง D1S80 ค่ะ ซึ่งตามทฤษฎีเนี้ยมันต้องเกิด 1 หรือ 2 band หลังจากที่มา run บน agarose gel ใช่ไหมคะ แต่ที่พบปัญหา คือ พบว่าบน gel กลับพบ 3 band เลยอยากถามว่ามันเกิดจาก non specific primer หรือป่าว หรือเกิดจาก contaminate ในระหว่างที่สกัด DNA คะ

ขอโทษสำหรับหนู ไม่แสดงตน [IP: 61.90.13.192] ด้วยนะคะที่เพิ่งเข้ามาเห็นคำถาม ถ้ายังติดตามอยู่ จะขอให้ส่งสิ่งที่หนูแปลมาให้ดูหน่อยนะคะ ที่อีเมลติดต่อ น่ะค่ะ แล้วจะได้ช่วยบอกความแตกต่างให้ค่ะ ในส่วนของคำอธิบายภาษาอังกฤษหาได้หลายแหล่งมากค่ะ หนูคงมีอยู่แล้ว

ส่วนหนู ไม่แสดงตน [IP: 117.47.232.126] ต้องพิจารณาหลายขั้นตอนค่ะ เริ่มตั้งแต่ว่า หนูใช้ primer ตัวไหน sequence เป็นอย่างไร ลอง BLAST เช็ค product ดูก่อนหรือยังว่า ได้เป็นอะไรมาบ้าง ส่วน band ที่หนูได้มา 3 band นั้นมีขนาดตรงกับที่เขาบอกไว้ด้วยหรือเปล่า condition ที่ใช้ตรงกับเขาหรือไม่ ถึงจะตอบคำถามที่หนูสงสัยได้ค่ะ

OOM
IP: xxx.12.97.115
เขียนเมื่อ 

สวัสดีค่ะ

ตอนนี้กำลังจะออกแบบ specific primer อยากทราบหลักการออกแบบ primer โดยไม่ใช้โปรแกรมคอมพิวเตอร์ (manual) ว่ามีวิธีการและหลักการอย่างไรค่ะ ขอบคุณมากค่ะ

เห็นคำถามของคุณ OOM [IP: 202.12.97.115]แล้ว สงสัยว่าทำไมถึงอยากออกแบบเองคะ ต้องคำนึงถึงอะไรหลายอย่างมากเลยค่ะ ลองอ่านดูได้ที่ http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html เราเช็คได้ไม่ถ้วนถี่แน่นอนเลยค่ะ แถมถ้าสั่งมาลอง optimise เองด้วยยิ่งงานหนักโดยไม่จำเป็นเลยค่ะ ยังไงก็ต้องใช้พวก โปรแกรมต่างๆในการตวจสอบคุณสมบัติของ primers ที่เราออกแบบอยู่ดีค่ะ

benz
IP: xxx.27.226.116
เขียนเมื่อ 

รบกวนอาจารย์หน่อยครับพอดีผมทำโปรเจคเกี่ยวกับbioinformatic โดยทำหัวข้อจะหา genetic marker ที่เหมาะสมในการวินิจฉัยเชื้อ infruenza virus ด้วนเทคนิค multiplex pcr ตอนนี้ผมไม่ค่อยมีความรุ้ด้านโมเลกุลาเลยครับอยากให้อาจารย์ช่วยเเนะนำด้วยครับเเล้วก็ตอนนี้ผมอยากได้หลักการเทคนิค multiplex pcr รบกวนอาจารย์ช่วยลงให้หน่อยนะครับขอเป็นภาษาไทยนะครับ

ตอนนี้อ่านเปเปอก็ไม่รุเรื่งเลยครับเพราะอ่อนภาษาอังกฤษมากๆ

สวัสดีค่ะ คุณ benz [IP: 125.27.226.116] เขียนได้น่ารักน่าช่วยมากเลยค่ะ แต่ว่าหัวข้อ multiplex PCR ก็ไม่ง่ายที่จะอธิบายกันได้ในระยะเวลาหรือบทเรียนสั้นๆหรอกนะคะ ในเวลาอันสั้นที่ต้องการความรู้เรื่องนี้ แนะนำให้หา review paper ที่เกี่ยวกับเรื่องนี้อ่านดูนะคะ แต่ยังไงๆก็คงต้องพยายามแกะภาษาอังกฤษให้ได้อยู่ดีค่ะ

เวลาอ่าน paper ก็ให้สแกนดูกว้างๆก่อน ไม่ต้องอ่านหมดทุกตัวอักษร รู้จักดู keywords มองหาประโยคแต่ละประโยค แล้วคิดแบบรวมๆอย่าแปลเป็นคำๆ ลองพยายามดูนะคะ ยังไงๆเรียนสาขานี้แล้ว เลี่ยงข้อมูลภาษาอังกฤษไม่ได้แน่ๆค่ะ ก็ต้องลุยและหาวิธีอ่านให้เป็นดีกว่านะคะ

ถ้าอยากให้ช่วย อาจจะส่งเปเปอร์ที่อ่านแล้วไม่เข้าใจมาถามทางอีเมล อีเมลติดต่อ ดูนะคะ

  รายการนี้มีมากกว่า 100 ความเห็น