ได้รับคำถามเกี่ยวกับ
PCR ที่คิดว่า คงเป็นปัญหาที่หลายๆคนอาจจะพบเจอ
และน่าจะนำมาแลกเปลี่ยนพูดคุยกันได้ทางบล็อกนี้ ก็เลยขอนำมาคั่นรายการ
Basic Real-time PCR เสียก่อน
เป็นปัญหาเกี่ยวกับ primer
ที่มีใจความคำถามดังนี้ค่ะ
"อยากทราบว่าในการทำ PCR
ปํญหาที่อาจเกิดขึ้นจะแก้อย่างไร เช่น ถ้า Forward and Reward Primer
มีค่า Tm ต่างกัน จะทำอย่างไร อุณหภูมิของ step ที่3
(elongation)จะใช้เท่าไรดูจากตัวแปรไหนบ้างคะ
อัตราการต่อสายหาได้ยังไงคะ และสุดท้ายวิธีลด non-specific band
ทำอย่างไรได้บ้าง รบกวนช่วยตอบข้อสงสัยหน่อยนะคะ
หรือช่วยแนะนำข้อมูลหรือหนังสือก็ได้ค่ะ"
จากประสบการณ์ของตัวเองพบว่า
การทำ PCR
นั้นเป็นวิธีการที่เรียกได้ว่าเป็นศิลปะอย่างหนึ่งทีเดียว
ไม่มีคำตอบตายตัวใดๆ ทุกอย่างเป็น empirical process ทั้งนั้น
และคนที่มีความคิดยืดหยุ่นโดยใช้หลักการพื้นฐานทางชีวเคมีจะสามารถแก้ปัญหาได้หลากหลายรูปแบบ
ทฤษฎีมีไว้ช่วยในการคิดเท่านั้นเองค่ะ เพราะฉะนั้น
สิ่งที่ต้องมีอย่างแรกก็คือ ความรู้พื้นฐานเกี่ยวกับส่วนประกอบต่างๆของ
PCR
ซึ่งจะหาอ่านได้หลากหลายที่มากๆค่ะ
สำหรับ 2-3 คำถามข้างบนนี้
มีความรู้พื้นฐานที่ใช้หาคำตอบได้ที่นี่ (
เป็นส่วนหนึ่งของ The
Bio-Web ซึ่งเป็นเว็บไซต์ที่ Dr. Andrew
Kropinski แห่ง Queen's
University ของแคนาดาได้จัดทำขึ้นเพื่อเป็นวิทยาทาน
เห็นว่าเป็นที่รวมของสิ่งที่มีประโยชน์มากๆค่ะ) เอาให้ตรงคำถามจริงๆ
ก็คือ
- สำหรับคำถามแรก
อยากให้ลองเข้าไปใช้โปรแกรม Primer3
ที่มีลิงค์จากเว็บไซต์นั้นแหละนะคะ ใส่ sequence ที่ต้องการ amplify
เข้าไป พร้อมกับ primer ตัวใดตัวหนึ่ง (จะเป็น forward หรือ reverse
ก็ได้ค่ะ) แล้วจะได้รับ primer
ที่จะมาคู่กับตัวที่เราใส่เข้าไปหลายๆตัว
ถ้าไม่มีตัวไหนเหมือนตัวที่เรามีเลย น่าจะแสดงว่าเราควรจะเปลี่ยน
primer ค่ะ เพื่อให้ Tm ไปกันได้ ไม่ต่างกันมาก
จากประสบการณ์ตรงของตัวเองนี่ บอกได้เลยว่า การตัดสินใจเปลี่ยน primer
จะเสียเวลาและค่าใช้จ่ายน้อยกว่าการทนทู่ซี้ optimize primer set
ที่ค่า Tm ไปด้วยกันไม่ได้นะคะ
- คำถามที่สอง ปกติถ้าใช้ Taq polymerase ก็จะเป็น
72 C อยู่แล้วค่ะ อุณหภูมิตรงนี้ก็จะขึ้นกับเอนไซม์ที่เราใช้
extend สาย nucleotide
ของเรานั่นเองค่ะว่าเขาทำงานได้ดีที่อุณหภูมิเท่าไหร่
ต้องศึกษาจากคุณสมบัติของเขาทั้งอุณหภูมิและอัตราการต่อสายนะคะ
- ส่วนการลด
non-specific band นั้นก็คือการ optimize reaction ของเรา
ซึ่งอันนี้ก็จะต้องเริ่มจากการทดลองด้วยสภาวะพื้นฐานก่อน
จะดูได้จากตารางที่มีส่วนประกอบของการทำ
PCR จากลิงค์ที่ให้นี้ แล้วลอง
run ดูก่อนที่จะปรับความเข้มข้นของส่วนประกอบต่างๆ
สำหรับตัวเองจะเริ่มที่การปรับ Mg++ ค่ะ
หวังว่าจะมีท่านอื่นๆที่เคยพบปัญหานี้แล้วแก้ไขแบบอื่นๆ
จะเข้ามาแลกเปลี่ยนประสบการณ์กันนะคะ ใครที่กำลัง optimize reaction
อยู่อยากถามอะไรอื่นๆอีก
ก็จะได้ใช้เป็นศูนย์กลางติดต่อกันได้ค่ะ