ขออธิบายคร่าวๆถึงสาเหตุที่น่าจะเป็นนะคะ

ข้อแรก การดู melt peak เป็นการดู PCR product ซึ่งอุณหภูมิที่มันแยกจากกันนั้นไม่เกี่ยวกับอุณหภูมิตอนทำ PCR นะคะ เพราะฉะนั้นไม่สามารถจะเอามาเป็นตัวบอกว่าเราจะสามารถทำ multiplex กับ products 2 ตัวนี้ได้ เพราะการจะทำ multiplex PCR ให้ได้ product 2 ตัวนั้นสิ่งที่ต้องคำนึงมากๆก็คือ primers คู่ที่ใช้น่ะค่ะ ถ้า sequence ของทั้ง 4 ตัวมีแนวโน้มจะ anneal กันเองมากกว่าจะไป anneal กับต้นแบบที่เราต้องการ amplify ก็จะเกิดปัญหาอย่างที่หนูพบนี่แหละค่ะ

หนูต้องไปเช็คดู primers ทั้ง 2 คู่ของหนูด้วยโปรแกรมเช่น Primer3 (free on web หาจากพี่ Google ได้ค่ะ) ถ้าหากว่าพอใส่ทั้ง 2 sets เป็น multiplex แล้วได้แต่ primer dimer ก็มีแนวโน้มว่า เจ้า primers ทั้ง 4 ชิ้นของหนู เขาชอบเกาะกันเองมากกว่าจะไปทำหน้าที่ต่อสายเจ้า product ที่เราต้องการจริงๆ น่าจะต้อง design primers ใหม่นะคะ แล้วก็ตรวจสอบจากโปรแกรมต่างๆที่ใช้ในการ design primers นี่แหละค่ะว่า sequence ของ primers จำเพาะกับ template มากกว่า คู่ primers ที่เราจะใส่มันลงไปพร้อมกัน ไม่ง่าย แต่ไม่ยากนะคะ ได้ผลยังไงเขียนมาคุยกันใหม่ได้นะคะ