Basic Real-time PCR (2): ขั้นตอนพื้นฐานของ PCR
นำเอกสารที่เขียนไว้เพื่อการอบรมเชิงปฏิบัติการ Realtime PCR and its applications มาลงต่อจากตอนแรกค่ะ อันนี้ถ้าดูรูปจะเห็นภาพจำได้ง่ายขึ้น วันหลังจะหามาใส่ไว้ด้วยนะคะ
ปฏิกิริยาประกอบด้วย 3 ขั้นตอนหลักของการปรับเปลี่ยนอุณหภูมิที่วนไปวนมา 30 ถึง 40 รอบ ในเครื่อง thermocylcer คือ
Denaturation: ที่อุณหภูมิ 95 °C เป็นการทำลายพันธะระหว่าง nucleotides ทำให้สาย DNA ที่ม้วนเกลียวอยู่เป็นคู่แยกออกจากกันเป็นเส้นตรง 2 เส้น และที่อุณหภูมินี้ปฏิกิริยาต่างๆจากเอนไซม์ในรอบก่อนหน้านั้นจะหยุดลงหมด
Annealing: ที่อุณหภูมิประมาณ 50 °-60°C เพื่อให้ primer ไปเกาะติดกับ template เพื่อเตรียมตัวตั้งต้นต่อสายคู่ของ template
Extension: ที่อุณหภูมิ 72 °C ซึ่งเป็นอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์ polymerase ทำให้มีการนำ base ต่างๆมาต่อทางด้าน 3’ ของ primer โดยต่อให้ complementary กับ sequence บน template ที่ primer มาเกาะไว้แล้วนั่นเอง
ทำให้เกิดการสร้าง DNA ต่อเนื่องได้มากเพราะเป็นการสร้างแบบเพิ่มจำนวนทวีคูณ คือถ้าเริ่มจาก DNA template สายคู่สา่ยเดียว เมื่อถึงวงจรที่สอง จะมีจำนวน PCR product เพิ่มขึ้นเป็น 2 คู่ ซึ่งแต่ละคู่เมื่อผ่านขั้นตอนของ PCR ในรอบที่สามจะได้ PCR product ออกมาเป็น 2 3 คู่ การเพิ่มจะเป็นแบบ exponential ได้ product ใน n cycle เป็น 2 n คู่ นั่นคือในรอบที่ 30 จะมีจำนวน DNA เพิ่มขึ้นเป็นจำนวนทั้งหมดถึง 2 30 = 1,073,741,764 คู่
ตอนต่อไป ธรรมชาติของปฏิกิริยาPCR
ดาวน์โหลดเอกสารทั้งฉบับได้ตรงนี้เลยค่ะ Basic RealTime PCR
ความเห็น (15)
อยากทราบว่า เราจะหาค่า LOD จากวิธี RT-PCR ได้ยังไงคะ คือหนูอ่านเปเปอร์แล้วงงมากเลยค่ะ ในเปเปอร์เค้า inoculate เชื้อมตฐ ลงใน ตัวอย่างอาหาร แล้วได้ค่า LOD ออกมาเป็น CFU/g หนูไม่ทราบว่าค่านี้มาได้อย่างไร รบกวนตอบหน่อยนะคะ
ต้องขอชื่อเปเปอร์ที่สงสัยมานะคะจะได้ช่วยอธิบายถูก เพราะวิธีการที่เราจะหา Limit of detection ใน RT-PCR นั้น ถ้าเข้าใจหลักการก็น่าจะหาได้อยู่แล้ว เพราะถ้าเรารู้ปริมาณของตอนเริ่มต้น เราก็สามารถจะทำ dilution ไปเรื่อยๆแล้วเอาไป run ด้วย condition ที่เราควบคุมได้ ก็จะรู้ว่าที่ความเข้มข้นใดที่ไม่สามารถตรวจพบอย่างแม่นยำได้ด้วยวิธีที่เราทำอยู่
Development of a multiplex real-time PCR method for pathogenic Vibrio
parahaemolyticus detection (tdh+and trh+)
Alejandro Garrido, María-José Chapela, Martiña Ferreira, Miroslava Atanassova, Paula Fajardo, Jorge Lago,
Juan M. Vieites, Ana G. Cabado*
หนูไม่เข้าใจในส่วนของการหา LOD อ่ะค่ะว่ามันเป็นยังไงมายังไง หนูนึกภาพการทดลองไม่ออกอ่ะค่ะ และจากตารางที่4 อ่ะค่ะที่มี b ตัวเล็กอยู่ คือเอาเชื้อที่ความเข้มข้นเท่าไรไป inoc แล้วก้อ ในตัวอย่างที่เหลือเอามาทำยังไงต่อ ใส่เชื้อเท่าไร เพื่อศึกษาแล้วได้ผล RT-PCR ออกมา
IAC คืออะไร ใส่ไปเพื่ออะไร เอามาจากไหน คำถามสุดท้ายคือ หนูจะ detect สัญญาณของ trh1 trh2 อย่างไรในเมื่อใช้ primer คู่เดียวกัน
ขอโทษที่สงสัยยืดยาวนะคะ คือหนูไม่มีความรู้ด้านนี้จริงๆค่ะ เลยสงสัยเยอะแยะมากเลย รบกวนด้วยนะคะ ขอบคุณมากค่ะ
การหา LOD ของงานนี้เขาใช้วิธีเติมเชื้อที่รู้ความเข้มข้นที่เขา serially dilute ลงไปในตัวอย่าง 10 ตัวอย่าง อีก 1 เป็น control neg.ตัวอย่างที่เขาใส่เชื้อไปก็เอาไปสกัด DNA ทำ RT-PCR เพื่อตรวจหาเชื้อว่า detect ได้จนถึง dilution ไหนนั่นเอง จำนวนเชื้อเขาก็คิดมาจากส่วนที่เขาเอาไปลง plate เพื่อนับว่าแต่ละ diluted sample นั้น (ที่เขาใส่ไปในตัวอย่าง) มีจำนวน cfu เท่าไหร่ เขาอธิบายไว้ตรงนี้ค่ะ
To evaluate the LOD of both methods, ISO and RT-PCR, boiled frozen mussels were used. 11 samples were weighted, 10 to determine the LOD and 1 blank in order to control the absence of pathogenic V. parahaemolyticus in the original sample. Our criterium for the acceptance of the LOD was 90% of detection.
Turbidity of the bacterial culture grown at 37 °C overnight on APW was adjusted to 0.5 McFarland and ten-fold serially diluted. All ten samples were contaminated with 1 mL of −7 dilution of each trh+, V. parahaemolyticus CCUG 43364 and CCUG 43365, and V. parahaemolyticus CECT 5271 as tdh+. Serial dilutions used to inoculate the samples, were also seeded in plates with SNA in order to get a reference value of viable bacteria.
ส่วน IAC เขาอธิบายไว้ใน discussion ค่ะ บอกที่มาและเหตุผลเรียบร้อยเลย หนูอ่านและตามไปดู paper ที่เขาอ้างถึงเอานะคะว่าเตรียมยังไง อันนี้เป็น concept ธรรมดาของ real-time PCR ที่ต้องมีการ run internal control ของระบบที่เราศึกษา อย่างในคนก็จะใช้พวก house-keeping genes ของ food ก็เป็นอีกแบบตามที่เขาอธิบายนี่เลยค่ะ
One challenge derived by the use of PCR-based methods is the presence of PCR inhibitors in food (Blackstone et al., 2003) and environmental samples. While positive and negative controls are normally run with every PCR master mix to ensure the integrity of the reagents, PCR inhibitors in the sample matrix can prevent the amplification of the target template, resulting in false-negative reporting. Therefore, it is necessary to include an IAC in each individual reaction mixture. Previous works have utilized various methods of developing and using IAC, including, but not limited to, housekeeping genes and synthetic plasmid constructs (Nordstrom et al., 2007). We chose a previously described IAC (Calvo et al., 2008) to be added to our RT-PCR method. It consists of a chimerical DNA with its own primers and probe to be co-amplified with our target genes. This IAC had not been previously applied to a multiplex RT-PCR method. It did not show any problem of cross reactivity neither with the targets searched nor with the bacterial strains tested from Table 1. Then, its applicability to our samples and targets has been completely demonstrated.
ส่วนคำถามที่สามเขาใช้วิธี hybridization probe ในการ detect genes 2 ตัวนี้ค่ะ ก็เลยใช้ primers ในการ amplify เฉยๆไม่ใช่ตัวแยก product ถ้าเป็นอีกแบบที่เขาใช้ Syber green เขาจะดู melting curve อันนั้นแต่ละ gene ก็จะต้องมี primer ของตัวเอง อ่านจากใน Introduction ของ paper ดูนะคะ
paper นี้ถือว่าเขาทำงานได้ค่อนข้างละเอียดครอบคลุมดีค่ะ ถ้าจะอ่านให้เข้าใจอาจจะต้อง break เป็นส่วนๆเพราะเขาทำงานเยอะมาก เปรียบเทียบทั้งการเลือกใช้ media ทั้งการ extract DNA แล้วยังเปรียบเทียบ performance ของวิธี culture กับ RT-PCR ด้วย ถ้าไม่แบ่งดูงานเป็นส่วนๆของเขา คนอ่านที่ไม่คุ้นกับงานแบบนี้อาจจะงงได้ค่ะ
ถ้าจะให้ดีควรจะอ่าน paper แบบนี้ร่วมกับเพื่อนๆที่ทำงานลักษณะเดียวกันนะคะ จะได้ช่วยกันคิด ช่วยกันหาคำตอบของสิ่งที่สงสัย เพราะคำตอบทั้งหมดที่หนูถาม มันก็อยู่ใน paper นี้เลยค่ะ เขาอธิบายไว้ดีแล้ว เพียงแต่เราต้องหาให้เจอเท่านั้นเอง ต้องอ่านให้รู้โครงเรื่องก่อนว่าอะไรอยู่ตรงไหน เราจะได้หาคำตอบของคำถามที่เราต้องการเจอค่ะ
อาจารย์คะ คือหนูต้องเตรียมสัมมนาอ่ะคะหนูปรึกษาเพื่อนๆเกี่ยวกับการเรียงเนื้อหา ซึ่ง งงกันมากก จำเป็นรึเปล่าที่เราต้องเรียงเนื้อหาตามเปเปอร์ คือหนูดูแล้วหัวข้อนี้มันน่าจะขึ้นก่อนอันนี้ เช่น 1สายพันธุ์เชื้อที่ทดสอบขึ้นก่อน แล้วค่อยไป 2 media comparison 3 sampling and preparation of sample จากนั้น 4 ทดสอบการสะกัดดีเอ็นเอทั้งสี่วิธี 5 คือหา LOD แล้วค่อยแยกออกเป็นการหาด้วย ISO กับการหาโดย RT 6 estimation sensitivity...
หนูเข้าใจกระบวนการแบบนี้อ่ะค่ะ ไม่ทราบว่าหนูเรียงเนื้อหาถูกต้องรึเปล่าคะ รบกวนอาจารย์ชี้แนะด้วยค่ะ
ได้เลยค่ะ ถ้าเราจะอธิบายให้คนอื่นเข้าใจ เราต้องเข้าใจก่อน ถ้าหนูแบ่งหัวเรื่องตามที่บอกมาแล้วหนูสามารถอธิบายให้มัน Flow ตามนั้นได้ก็ใช้ได้เลยค่ะ งานของ paper นี้เหมาะที่จะเอามาทำสัมมมนาจริงๆค่ะ ได้หลายเรื่องเลย
อาจารย์คะ คือหนูหาคำตอบในส่วนนี้ไม่ได้อ่ะค่ะ ตรงตารางเปรียบเทียบการสกัดดีเอ็นเอทั้ง สี่วิธี คือค่า tresh cycle มันเป็นจำนวนรอบของปฏิกิริยาที่สามารถตรวจพบผลพีซีอาร์ ในระดับที่สูงกว่า background signal โดยใน M3 มีค่า tresh cycle สูงสุด ซึ่งสอดคล้องกับ conc DNA ที่ต่ำสุด แต่ทำไม M1 ซึ่งมี tresh cycle สูง มี conc DNA สูงสุด มันไม่สอดคล้องกันเลยค่ะ หนูเลยงงอ่ะค่ะ
ขออีกคำถามนะคะ คือ IAC ทำไมเปเปอร์นี้เค้าใส่แค่ RT ทำไมไม่ใส่ใน PCR ธรรมดาด้วย คือหนูเข้าใจว่าการใส่ IAC เป็นการคอนโทรลปฏิกิริยาของเรา ดูว่ามันโอเคไม๊ มีตัวยับยั้งในปฏิกิริยาที่จะทำให้เกิดผลลบปลอมหรือเปล่า ซึ่งใน RT มีการคอนโทรล แต่ทำไม PCR ธรรมดาถึงไม่ใส่ด้วย แล้วจะทราบได้อย่างไรคะว่า ผลขอล PCR ที่ออกมาน่าเชื้อถือ ไม่ได้เกิดจากการผิดพลาดจาก inhibitor
ขอโทษที่รบกวนตลอดเลยนะคะ คือหนูพยายามอ่าน เปเปอร์ที่เป็นภาษาอังกฤษเพื่อข้อมูล แต่หนูก็ยัง งง อยู่ดี คือภาษาหนูแย่มากเลยค่ะTT ขอบพระคุณอาจารย์ที่ช่วยเหลือให้คำแนะนำมาตลอดนะคะ_____/\_____
ตอนนี้ไม่ได้อยู่ตรงนี่อ่าน paper นี้ได้โดยตรงหนูตัดแปะตารางที่สงสัยมาให้ด้วยนะคะ จะได้อธิบายถูก (ส่วนมากเขาจะพูดใน discussion หนูอ่านดูหรือยังคะ)
ส่วน IAC เขามักจะใช้เพื่อดูการที่ reverse transcribe RNA มาเป็น DNA น่ะค่ะ เพราะคุณภาพของ RNA เป็นเรื่องที่เราประเมินได้ยาก จึงใช้วิธีประเมินจาก IAC ของระบบนั้นๆน่ะค่ะ เขาไม่ได้ใช้เพื่อตรวจสอบการทำ PCR เพราะใน PCR เราก็ต้องมี positive control ที่เรารู้, มี negative control ที่ไม่มี template อยู่ในทุก run อยู่แล้วค่ะ
DNA extraction methods comparison
| Extraction method | Thresh cycle | Concentration |
Purity 260/280 abs |
Time (min.) |
| M1 (Blanco-Abad et al., 2009) |
29.17 +-0.84a | 173.99 +-26.73a | 1.51 +-0.12a |
45 |
| M2 (Blanco-Abad et al., 2009) |
27.50 +-0.69a | 149.02 +-6.72a | 1.50 +-0.01a |
25 |
| M3 (Tyagi et al., 2009) |
32.47 +- 0.61b | 74.06 +-0.08b | 1.48 +-0.35a |
45 |
| M4 Kit | 27.77 +-0.76a | 79.69 +-15.31b | 2.45 +-0.05b |
90 |
a-b Different lower case letters in the same column indicate a statistically significant
difference (p < 0.05).
โดย M1 M2 M3 จะใช้วิธี boil DNA ธรรมดา แต่ขั้นตอนของ M1 M2 จะ resuspended ใน Tris EDTA (TE) buffer 1X ส่วน M3 จะ resuspended ใน Sterile milliQ water และมีแค่ M1 เท่านั้นที่ บ่มด้วย Chelex 5% เป็นเวลา 20 นาที ที่ 56 องศา ส่วน M4 เป็นชุด Kit Nucleospin Tissue ค่ะ
อาจารย์คะ มันแทรกรูปไม่ได้อ่ะค่ะ ไม่ทราบว่าหนูต้องแทรกตรงไหนหรือคะ เพราะกดปุ่มแล้วมันขึ้นให้ลิงค์ พอส่งไปก็ไม่ติด อันนี้หนูสร้างเอง เลยมั่วมากเลยค่ะ
เท่าที่จำได้จากตอนที่อ่านครั้งแรกตอนที่ตอบหนูนั้น รู้สึกว่าเขามีอธิบายสิ่งที่หนูถามมาใน result กับใน discussion นะคะ แต่มันอาจจะไม่ต่อเนื่องกันเท่านั้นเอง หนูลองหาดูดีๆ พี่อ่านผ่านๆแต่ก็รู้สึกจำได้ว่าเขาพูดถึงสิ่งที่หนูสงสัยอยู่เหมือนกันนะคะ ลองหาดูดีๆอีกทีนะคะ
อาจารย์คะ หนูสอบสัมมนาเสร็จแล้วค่ะ^^
ขอขอบพระคุณอาจารย์สำหรับคำแนะนำ และความเช่วยเหลือนะคะ ขอบพระคุณจริงๆค่ะ^^