การหา LOD ของงานนี้เขาใช้วิธีเติมเชื้อที่รู้ความเข้มข้นที่เขา serially dilute ลงไปในตัวอย่าง 10 ตัวอย่าง อีก 1 เป็น control neg.ตัวอย่างที่เขาใส่เชื้อไปก็เอาไปสกัด DNA ทำ RT-PCR เพื่อตรวจหาเชื้อว่า detect ได้จนถึง dilution ไหนนั่นเอง จำนวนเชื้อเขาก็คิดมาจากส่วนที่เขาเอาไปลง plate เพื่อนับว่าแต่ละ diluted sample นั้น (ที่เขาใส่ไปในตัวอย่าง) มีจำนวน cfu เท่าไหร่ เขาอธิบายไว้ตรงนี้ค่ะ

To evaluate the LOD of both methods, ISO and RT-PCR, boiled frozen mussels were used. 11 samples were weighted, 10 to determine the LOD and 1 blank in order to control the absence of pathogenic V. parahaemolyticus in the original sample. Our criterium for the acceptance of the LOD was 90% of detection.

Turbidity of the bacterial culture grown at 37 °C overnight on APW was adjusted to 0.5 McFarland and ten-fold serially diluted. All ten samples were contaminated with 1 mL of −7 dilution of each trh+, V. parahaemolyticus CCUG 43364 and CCUG 43365, and V. parahaemolyticus CECT 5271 as tdh+. Serial dilutions used to inoculate the samples, were also seeded in plates with SNA in order to get a reference value of viable bacteria.

ส่วน IAC เขาอธิบายไว้ใน discussion ค่ะ บอกที่มาและเหตุผลเรียบร้อยเลย หนูอ่านและตามไปดู paper ที่เขาอ้างถึงเอานะคะว่าเตรียมยังไง อันนี้เป็น concept ธรรมดาของ real-time PCR ที่ต้องมีการ run internal control ของระบบที่เราศึกษา อย่างในคนก็จะใช้พวก house-keeping genes ของ food ก็เป็นอีกแบบตามที่เขาอธิบายนี่เลยค่ะ

One challenge derived by the use of PCR-based methods is the presence of PCR inhibitors in food (Blackstone et al., 2003) and environmental samples. While positive and negative controls are normally run with every PCR master mix to ensure the integrity of the reagents, PCR inhibitors in the sample matrix can prevent the amplification of the target template, resulting in false-negative reporting. Therefore, it is necessary to include an IAC in each individual reaction mixture. Previous works have utilized various methods of developing and using IAC, including, but not limited to, housekeeping genes and synthetic plasmid constructs (Nordstrom et al., 2007). We chose a previously described IAC (Calvo et al., 2008) to be added to our RT-PCR method. It consists of a chimerical DNA with its own primers and probe to be co-amplified with our target genes. This IAC had not been previously applied to a multiplex RT-PCR method. It did not show any problem of cross reactivity neither with the targets searched nor with the bacterial strains tested from Table 1. Then, its applicability to our samples and targets has been completely demonstrated.

ส่วนคำถามที่สามเขาใช้วิธี hybridization probe ในการ detect genes 2 ตัวนี้ค่ะ ก็เลยใช้ primers ในการ amplify เฉยๆไม่ใช่ตัวแยก product ถ้าเป็นอีกแบบที่เขาใช้ Syber green เขาจะดู melting curve อันนั้นแต่ละ gene ก็จะต้องมี primer ของตัวเอง อ่านจากใน Introduction ของ paper ดูนะคะ

paper นี้ถือว่าเขาทำงานได้ค่อนข้างละเอียดครอบคลุมดีค่ะ ถ้าจะอ่านให้เข้าใจอาจจะต้อง break เป็นส่วนๆเพราะเขาทำงานเยอะมาก เปรียบเทียบทั้งการเลือกใช้ media ทั้งการ extract DNA แล้วยังเปรียบเทียบ performance ของวิธี culture กับ RT-PCR ด้วย ถ้าไม่แบ่งดูงานเป็นส่วนๆของเขา คนอ่านที่ไม่คุ้นกับงานแบบนี้อาจจะงงได้ค่ะ

ถ้าจะให้ดีควรจะอ่าน paper แบบนี้ร่วมกับเพื่อนๆที่ทำงานลักษณะเดียวกันนะคะ จะได้ช่วยกันคิด ช่วยกันหาคำตอบของสิ่งที่สงสัย เพราะคำตอบทั้งหมดที่หนูถาม มันก็อยู่ใน paper นี้เลยค่ะ เขาอธิบายไว้ดีแล้ว เพียงแต่เราต้องหาให้เจอเท่านั้นเอง ต้องอ่านให้รู้โครงเรื่องก่อนว่าอะไรอยู่ตรงไหน เราจะได้หาคำตอบของคำถามที่เราต้องการเจอค่ะ