GeneMapper3: การสร้างกราฟแบบ local southern method ในงาน fragment analysis
จากบันทึกนี้ ผมได้กล่าวพาดพิงไปถึง algorithm ในการสร้างกราฟ แบบที่เรียกว่า local southern method พอดีได้ไปเจอกราฟ จากหนังสือ GeneMapper ID X ที่อธิบายถึงวิธีการสร้างกราฟแบบนี้ก็เลย เอามาฝากครับ
วิธีการสร้างกราฟแบบนี้ จะใช้การประมาณเส้นกราฟใหม่ขึ้นมา 2 เส้นครับ โดยใช้จุดที่ครอบคลุมตำแหน่งที่ต้องการตรวจ รวม 3 จุดด้วยกัน ยกตัวอย่างเช่น ต้องการประมาณค่าจุดสีน้ำเงิน ว่ามีขนาดกี่ bp
เส้นแรก ประมาณจากจุดใน standard curve 2 จุด ที่ต่ำกว่าจุดสีน้ำเงิน ในที่นี้คือ จุด a และ b กับอีก 1 จุดที่อยู่สูงกว่าจุดสีน้ำเงิน ในที่นี้คือ จุด c
เส้นที่สอง ประมาณจากจุดใน standard curve 1 จุด ที่ต่ำกว่าจุดสีน้ำเงิน ในที่นี้คือ จุด b กับอีก 2 จุดที่อยู่สูงกว่าจุดสีน้ำเงิน ในที่นี้คือ จุด c และ d
หาค่าเฉลี่ยจุดสีน้ำเงิน จากเส้นกราฟ ทั้งสอง ก็จะได้ขนาดของจุุดสีน้ำเงิน
เพราะฉะนั้นวิธีการนี้ เหมาะสำหรับการใช้คำนวณค่าจุด ที่มี standard curve อยู่ตรงกลางๆ ครับ พูดง่ายๆ คือ standard curve มีได้กี่จุด มันต้องตัด 2 จุดข้างล่างออก และตัด 2 จุดข้างบนออก ยกตัวอย่างเช่น Liz 500 มีจุดตั้งแต่ 35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250, 300, 340, 350, 400, 450, 490, 500 bp เจ้า Liz500 นี้มีข้อจำกัดที่จะนำมาใช้ในงาน fragment analysis ที่ตำแหน่ง 35 และ 50 bp ซึ่งเป็นช่วงที่ซ้อนกับ primer peak ต้องตัดออกไปโดยปริยาย ส่วนตำแหน่งที่เหลือ ก็ต้องเริ่มต้นตั้งแต่ 75 ขึ้นไปจนถึง 500 bp เมื่อตัดสองจุดล่าง และสองจุดบนออก ก็จะเหลือช่วงที่ใช้งานได้ คือตั้งแต่ 100 ขึ้นไปจนถึง 490 bp ครับ
แล้วมีข้อควรระวังประการถัด คือจุดที่ 250 bp และ 340 bp เป็นจุดที่ออกนอก standard curve ครับ ดังนั้นจึงควรตัด 2 จุดนี้ออกไปด้วย
โดยทั่วไปงานด้านนิติเวช มักจะทำ fragment analysis ในช่วงไม่เกิน 350 bp ดังนั้นค่าบนจึงไม่ค่อยมีปัญหาครับ สำหรับค่าล่าง หากใช้งาน identifiler ธรรมดา เริ่มจากขนาดของ amelogenin 106 bp ขึ้นไป ก็ใช้ได้ครับ ไม่มีปัญหา แต่ถ้าหาก จะนำไปใช้ในงานอื่นที่มีขนาดต่ำกว่า 100 bp เช่นในงาน minifiler หรือจะเป็น inhouse fluorescent PCR การสร้างกราฟด้วยวิธี local southern method นี้ ถือว่าไม่เหมาะสมครับ ต้องหันไปใช้วิธีสร้างกราฟแบบอื่น
กรณีที่ต้องการประมาณค่าขนาดที่น้อยกว่า 100 bp ท่านสามารถทำได้หลายอย่างครับ อย่างเช่น
1. ใช้ Liz 500 เป็น internal size standard เช่นเดิม แต่ว่าเปลี่ยนวิธีการสร้างกราฟ จาก local southern method มาเป็น 3rd order least squares method ซึ่งเป็นวิธีสร้างกราฟจากการประมาณค่า regression equation ซึ่งจะสามารถคำนวณขนาดได้จากทุกจุดที่อยู่บน standard curve
2. เปลี่ยน internal standard จาก Liz 500 มาเป็น Liz 600 ซึ่งจะมีจุดที่ละเอียดขึ้น แต่ยังคงใช้วิธีสร้างกราฟแบบ local southern method เช่นเดิม
สำหรับห้องแล็บที่ ม.อ. เราเลือกใช้ ข้อที่ 1 ครับ เพราะมี Liz 500 อยู่แล้ว ไม่ต้องลงทุนเพิ่ม เพียงแค่เปลี่ยน algorithm ในการสร้างกราฟใหม่เท่านั้น เพียงแต่ตอนนี้ เริ่มมาคิดว่า ทางเลือกที่ 2 ก็น่าสนใจครับ
การใช้ Liz 600 ในงานตรวจ identifiler เป็นทางเลือกหนึ่งที่น่าสนใจครับ เพราะ Liz600 มีจุดบน standard curve ที่มากกว่า Liz 500 ทำให้ประมาณค่าขนาดได้ถูกต้องมากกว่า และเท่าที่ทราบมา คือเจ้า Liz 600 ไม่มีจุดที่ต้องตัดออกจาก standard curve ครับ สามารถใช้ได้ทุกจุด เพียงแต่ยังไม่เคยลองทำ เพราะต้องลงทุนซื้อ Liz 600 ใหม่ แล้วคำถามต่อไปคือ เจ้าความเข้ม (fluorescent intensity) ของ Liz 600 กับ Liz 500 มันต่างกันหรือไม่เพียงใด พูดง่ายๆคือถ้าต้องการให้เจ้า Liz500 กับ Liz600 มีความเข้มเท่ากัน มันต้องเจือจากต่างกันหรือไม่อย่างไร ผมไม่มีข้อมูลครับ ใครเคยลองใช้ทั้งสองตัวนี้แล้ว ช่วยบอกด้วยสิ.....เพราะคำตอบนี้ หมายถึง การเลือกใช้ Liz 500 กับ Liz 600 ตัวไหนจะประหยัดตังค์ในกระเป๋ามากกว่ากัน ?
ความเห็น (2)
ไม่แน่ใจว่าคุณ Mitoฯ เห็น presentation นี้หรือยังนะคะ เผื่อมีประโยชน์ เขาอธิบายดีเหมือนคุณ Mitoฯเลย http://www.cstl.nist.gov/strbase/pub_pres/ISHI2011-TLs-3500.pdf
ขอบคุณมากครับ พี่โอ๋ ยังไม่เคยเห็นครับ เป็นข้อมูลการ validate เครื่อง AB 3500 ซึ่งเป็นเครื่อง sequencer ตัวใหม่ของ Applied Biosystems ครับ เครื่องรุ่นใหม่นี้ ใช้ระบบ RFID ติด tag กับน้ำยาครับ เพราะฉะนั้น เครื่องจะตรวจสอบน้ำยา และวันหมดอายุ ทำให้น้ำยาประเภทที่เตรียมขึ้นใช้เอง ใช้กับเครื่องไม่ได้แล้วครับ และพอหมดอายุ ก็ต้องทิ้งน้ำยาที่เหลือ ลักษณะของเครื่องแบบนี้ ไม่ค่อยเหมาะกับผมครับ เพราะผมมันดื้อ...ครับ