GeneMapper2: ใช้ Liz 500 internal size standard มาตัด size 340 bp ทิ้งดีกว่า

     ปัญหาของการทำ fragment analysis ที่ใช้ Liz 500 เป็น internal size standard อย่างหนึ่งที่อาจไม่พบบ่อยมาก แต่ก็พบได้เรื่อยๆ ก็คือ การที่มี size ขนาด 300-350 bp ขึ้นขนาดผิดพลาด โดยขึ้นเป็น OL (off-ladder) อย่างภาพข้างล่างนี้ครับ

     ปัญหานี้เกิดจากการที่ใช้โปรแกรม GeneMapper แล้วset ให้ size standard เลือกเป็น CE_G5_HID_GS500 ตามที่แนะนำไว้ในชุดน้ำยา Identifiler

     วิธีแก้ปัญหานี้ คือเปลี่ยนตัว size standard ใหม่ครับ ในที่นี้ผม set เป็นตัวใหม่ขึ้นมา ตั้งชื่อว่า Liz500No340 โดยเจ้า size standard ตัวใหม่นี้จะ set ตาม Liz 500 แต่ให้ตัดตำแหน่ง  250 และ 340 bp ออกครับ พอแก้ไข size standard ใหม่แล้วมาลองวิเคราะห์ใหม่ ดังภาพ

     เมื่อกดปุ่ม run จะได้  size ทุกตำแหน่งถูกต้องครับ ดังภาพข้างล่าง

      เหตุผลที่ใช้อธิบายปรากฎการณ์นี้ก็คือ เจ้า Liz 500 ที่เราใช้เป็น size standard ในงาน fragment analysis ในเครื่องวิเคราะห์ลำดับเบสอัตโนมัติแบบที่เป็น capillary electrophoresis นั้นมี size ในช่วงที่เราใช้งาน คือ 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250, 300, 340, 350, 400, 450, 490 และ 500 bp ครับ แต่ size ทั้งหมดนี้ เมื่อไป plot กราฟ จริงๆ ปรากฎว่า เจ้า size ขนาด 250 bp มันไม่อยู่ใน slope เดียวกันกับตัวอื่นๆ พูดง่ายๆก็คือ เจ้า 250 bp นี้มันหลุดออกนอก curve ก็เลยเป็นเหตุผลให้บริษัทเอาเจ้า 250 bp นี้ออก แล้วพูดให้สวยหรูว่า ใช้ size 250 bp เป็น internal size standard ซึ่งเมื่อติดตามเจ้า size 250 bp ในการทำ fragment analysis จะพบว่าที่อุณหภูมิ  60 C เจ้า size 250 bp นี้ มันวัดได้จริงประมาณ 245.5-246.5 bp เท่านั้น ถ้าเมื่อไหร่ที่เครื่องวัดได้ size หลุดจากค่านี้ ก็มักจะเกิดปัญหา OL ขึ้นกับตำแหน่งอื่นๆ ด้วย

     แต่เราไม่ไปพูดถึง 250 bp ก็แล้วกัน เรามาพูดถึงตำแหน่ง 340 bp ซึ่งเป็นอีกจุดหนึ่งที่หลุดออกนอก standard curve เช่นเดียวกับ 250 แต่ค่านี้ถูกใส่เข้าไปใน curve ด้วยดังนั้นจึงเกิดความเสี่ยงมากที่โปรแกรมจะวิเคราะห์ผิดพลาดได้  แต่เนื่องจากโปรแกรม GeneMapper วิเคราะห์งาน fragment analysis ของชุดน้ำยาของ Applied Biosystems แบบ Local Southern Method โดยการหาค่าเฉลี่ยจาก curve 2 เส้น  เส้นแรก เป็นการประมาณโดยใช้ standard curve จาก 1 จุด ข้างล่าง กับอีก 2 จุดข้างบน นั่นคือหาก size ของเรามีขนาด 320 bp วิธีการวิเคราะห์แบบนี้ จะใช้จุดล่าง 1 จุด คือที่ 300 bp ร่วมกับจุดบนอีก 2 จุด คือที่ 340 และ  350 bp มาใช้ในการคำนวณ size ของเราที่มีขนาด 320 bp  แล้วเส้นที่สอง เป็นการประมาณจาก 2 จุดข้างล่างคือ 200 และ 300 bp ร่วมกับอีก 1 จุดข้างบน คือ 340 bp มาใช้ในการคำนวณค่าของเราที่มีขนาด 320 bp แล้วเอา curve ทั้งสองเส้นที่ประมาณได้นี้ มาหาค่าเฉลี่ย ก็จะได้ size ขนาด 320 bp ที่ใกล้เคียงกับความเป็นจริงมากที่สุด ปัญหาจะไม่เกิด หากจุดทุกจุดบน standard curve อยู่บน เส้น curve เหมือนกันหมดทุกจุด แต่อย่างที่ผมเล่าให้ฟัง เจ้าจุดที่ 340  bp มันออกนอก curve เพราะฉะนั้น เมื่อเอาจุดที่ออกนอก curve มาใช้ในการประมาณค่าด้วย มันก็จะประมาณค่าผิดพลาด ทำให้ได้ค่าออกมาคลาดเคลื่อน โปรแกรมก็เลยรายงานผลออกมาเป็นค่า OL การแก้ปัญหานี้ก็คือการเอาค่า  340 bp ออกจาก size standard ครับ

     ภาพข้างล่างเป็น size standard ของ CE_G5_HID_GS500 ซึ่ง set ไว้เป็น default จากโรงงานครับ จะเห็นว่าเขาเอา 250 bp ออกแล้ว แต่ยังคงมี 340 bp ค้างไว้อีก

     เราก็เพียง set size standard ใหม่ แล้วเอา  340 bp ออกด้วยเท่านั้น 

     สำหรับท่านที่ใช้งาน identifiler plus หรือ identifiler direct บริษัทจะมาเพิ่ม size standard ให้ใหม่ ซึ่ง size standard ตัวใหม่ที่ลงให้นี้ จะตัด 340 bp ออกไปแล้ว ทำให้ลดปัญหาการเกิด OL ในช่วงขนาด 300-350 bp ครับ เพราะฉะนั้น แม้ว่าท่านจะใช้งานน้ำยา identifiler ธรรมดา (น้ำย่ารุ่นเก่า) ผมก็แนะนำว่าให้เปลี่ยน size standard ใหม่ มาเป็น ตัวใหม่ที่ใช้กับน้ำยา identifiler plus หรือ identifiler direct ครับ  (ดังภาพข้างล่าง) แต่สำหรับท่านใดที่ไม่ได้เพิ่ม size standard ใหม่สำหรับน้ำยา identifiler plus หรือ identifiler direct ผมแนะนำให้ set size standard ใหม่ แล้วตัด 340 bp ออกไปครับ ปัญหานี้ก็จะลดลงได้ครับ