คู่มือการทดสอบ Special Tests : Ammonia (แอมโมเนีย)

Ammonia นับว่าเป็นการทดสอบพิเศษที่แพทย์ส่งค่อนข้างบ่อย มีอยู่ช่วงหนึ่ง พี่นุชสั่งซื้อน้ำยาสำเร็จรูป นำมาตรวจกับเครื่องวิเคราะห์อัตโนมัติ Hitachi 717 ค่ะ แต่น้ำยามีอายุสั้นมาก ๆ ค่ะ แล้ววิธีการก็ไม่ได้ง่าย เพราะต้องนำมาผสมกันหลายขั้นตอนก่อนทำ พอผสมเสร็จ น้ำยาก็อายุสั้นอีกไม่ถึงเดือน แต่การทดสอบ Ammonia จะ request เป็นช่วง  ๆค่ะ ช่วงไหนส่งเยอะ ก็เกือบจะได้ทำทุกวัน แต่ช่วงไหนหายไป ก็อาจจะไม่มีการสั่งตรวจเป็นเดือน  ๆ  เลยค่ะ อีกทั้งการใช้เครื่องวิเคราะห์อัตโนมัติ เราก็ต้องมาปรับค่า Factor ของน้ำยา อย่างน้อย 1-2  ครั้ง เพื่อให้ Control หรือสารควบคุมคุณภาพ ได้ตามต้องการ ตอนนี้เลยกลับมาทำ manual อีก สำหรับผู้เขียนสบายใจกว่ากันเยอะ

ความสำคัญ          
         อาหารโปรตีนที่เรากินจะถูกย่อยเป็นกรดอะมิโน และซึมเข้าสู่กระแสเลือดโดยผ่านทางผนังของลำไส้แล้วเข้าสู่ตับทางเส้นเลือดเฮปาติค พอร์ตัล กรดอะมิโนถูกสะสมไว้ชั่วคราวที่ตับแล้วจึงค่อย ๆ ถูกปล่อยออกไปตามเส้นเลือดดำ จากตับนำไปให้เซลล์ต่าง ๆ สร้างสารอื่นต่อไป          
         ในการนำกรดอะมิโนไปสร้างสารอื่นนั้น จะมีการกำจัดอนุมูลอิสระ (-NH2) ออกจากโมเลกุลของกรดอะมิโน ขบวนการนี้เรียกว่า ดีแอมมิเนชั่น (Deamination) จะมีการปล่อยแอมโมเนียออกมา  

         แอมโมเนียเป็นสารที่มีพิษต่อระบบประสาทส่วนกลาง ตับของคนและสัตว์ที่เลี้ยงลูกด้วยนมสามารถทำให้แอมโมเนียไปรวมกับคาร์บอนไดออกไซด์กลายเป็นยูเรีย ซึ่งเป็นสารที่มีพิษน้อยกว่า ถ้าตับไม่สามารถกำจัดแอมโมเนียได้หมด เซลล์สมองจะทำหน้าที่กำจัดแอมโมเนียด้วย โดยการให้แอมโมเนียไปทำปฏิกิริยากับกรดกลูตามิค (L-glutamic acid) ได้เป็นกลูตามีน (Glutamine ) จากการที่สมองนำเอากรดกลูตามิคมาใช้มากเกินไป ทำให้กรดกลูตามิคในสมองลดลง เป็นผลให้กรดคีโตกลูตามริค (Ketoglutaric acid) ลดลงไป การลดลงของ กรดคีโตกลูตาริค ทำให้พลังงานในวงจรของกรดซิตริก (Citric acid cycle) ลดลงไปด้วย และทำให้ออกซิเดทีฟเมตาบอลิสม ลดลง เมื่อเป็นเช่นนี้จะทำให้การหายใจน้อยลงจนหยุดหายใจในที่สุด

การเก็บสิ่งส่งตรวจ

          ใช้ EDTA blood แช่น้ำแข็งมาด้วย และต้องโทรมาบอกห้อง Lab. (เตรียมตัวและเตรียมใจไว้ก่อน) ต้องทำในทันทีค่ะ ไม่เช่นนั้นก็รีบนำไป Freeze ในตู้เย็นไว้ก่อน

 หลักการ โดยวิธี Enzymatic method ตามวิธีของ  Boehringer)

          โดยทั่วไปให้แอมโมเนีย ทำปฏิกิริยากับ a-Ketoglutarate  โดยมี NADH (Nicotinamide adenine dinucleotide reduced form) เป็น Co-enzyme และมีเอนซัยม์ Glutamate dehydrogenase เป็นตัวเร่งปฏิกิริยา 

 Glutamate dehydrogenase

a-Ketoglutarate + NH⁺+ NADH -à Glutamate + H₂O + NAD⁺

เนื่องจาก NADH เมื่อเปลี่ยนไปเป็น NAD นั้น จะทำให้ค่าการดูดกลืนแสง ที่ความยาวคลื่น 340 นาโนเมตร ลดลงซึ่งสามารถนำมาคำนวณหาปริมาณแอมโมเนียได้

น้ำยา
1.     Triethanolamine buffer 0.15 mmol/L pH8.6, a-oxoglutarate (คือ a-ketoglutarate) 15 mmol/L : ดูด Triethanolamine 4.98 ml (5.09 ml สำหรับ 98%) ชั่ง a-oxoglutaric acid 0.5479 g(0.5534 gสำหรับ 99%) ผสมกันในน้ำกลั่น ~ 200 ml ปรับ pH ด้วย NaOH แล้วปรับปริมาตรครบ 250 ml
2.     NADPH 0.10 mmol/L: ชั่ง NADPH (95 %, tetrasodium salt, MW 958.8) ละลายใน  buffer 1. แล้วแบ่งใส่หลอดละ 1mlà freeze (หรือ  0.0066 g/10 ml buffer)
3.     ADP (Adenosine 5’-diphosphate) 1.5 mmol/L : ชั่ง ADP monosodium salt, 96%, 1 H₂O (เพราะฉะนั้น MW = 426.2 + 23 + 18 = 467.2) ละลายใน buffer 1 แล้วแบ่งใส่หลอดละ 1mlà freeze (0.0474 g/10 ml buffer)
4.     Glutamate dehydrogenase (GLDH) ³ 755 U/ml : ชั่ง GLDH = 0.0020 g ละลายใน buffer สำหรับการทดสอบ 1 ราย เตรียมทันทีก่อนใช้
5.     working reagent : ก่อนทำการทดสอบ ผสม reagent 1 (buffer) 4.5 ml กับ 2. และ 3. อย่างละ 1 หลอด เป็น ซึ่งจะได้ total volume = 6.5 ml ทำได้ 1 ราย   

วิธีทำ                                        RB(ml)                   sample(ml)working reagent                  2.5                           2.5
EDTA plasma                              -                            0.5 
 Mix, ตั้งทิ้งไว้ 10 นาที ที่ 20 – 25  ⁰C อ่าน A₁ ของ RB และ sample (ใช้ dichromate ตัด OD ให้ได้เหมาะสม) ที่ 340 nm

Reagent 4.                                0.02                         0.02 
  Mix, ทิ้งไว้ 10 นาที ที่ 20 – 25 ⁰C,อ่าน A₂ ของRB และ sample

Reagent 4.                                 0.02                         0.02 
Mix, ทิ้งไว้ 10 นาที ที่ 20 – 25 ⁰C, อ่าน A₃ ของ RB และ sample 

การคำนวณ

D A_RB หรือ D A_sample = (A₁ - A₂ ) –  (A₂ - A₃ )
เนื่องจาก RB มี volume ไม่เท่ากับ sample เพราะฉะนั้นต้อง correct OD ของ D A_RB  ก่อนโดยดูค่าจากตาราง  

D ARB ทีวัดได้	D ARB correct	D ARB ทีวัดได้	D ARB correct
0.010	0.008	0.055	0.046
0.015	0.012	0.060	0.050
0.020	0.017	0.065	0.054
0.025	0.021	0.070	0.058
0.030	0.025	0.075	0.063
0.035	0.029	0.080	0.067
0.040	0.033	0.085	0.071
0.045	0.038	0.090	0.075
0.050	0.042

NH₃ (mg%) = 1633 X (D A_sample - D A_RB correct) 

 ค่าปกติ
           ผู้ชาย    25 – 94 mg% 
           ผู้หญิง  19 – 82 mg% 
           ถ้าได้ค่าสูงกว่า 700 mg% ให้เจือจาง plasma 0.5 ml ด้วย 2.00 ml freshly distilled, ammonium – free water แล้วทำใหม่ (absorbance difference (D A_sample X 5)

 ข้อสังเกต
         วิธีการตรวจวัดแอมโมเนียในเลือดปัจจุบันมีหลายวิธี คือ
         1.     Diffusion Method
         2.     Anion-exchange resin
         3.     Deproteinization
         4.     Enzymatic method
           5.  Electrochemistry

 เอกสารอ้างอิง
1. บุญพเยาว์ โลหะจินดา, เกรียงศักดิ์ อิ่มใจ, นันทยา ชนะรัตน์, ขวัญชัย รัตนเสถียร, พัตราภรณ์ ผลวัฒนะ, ไพโรจน์ สุภาวจิต, รุจาภา พิมสังข์, รุ่งศิริ โชติเวชกุล. คู่มือปฏิบัติการเคมีคลินิก. สำนักพิมพ์ภาควิชาเคมีคลินิก คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่  

[Ka-Poom]

คุณศิริ...

ยอดเยี่ยม...แห่งความขยัน review มากเลยคะ...

ครั้งแรกที่กะปุ๋มได้เจอท่าน อ.ปารมี...ประโยคแรกถามหา...คุณศิริ...ไม่มาด้วยเหรอคะ...

เพราะแอบติดตามงาน R2R ของคุณศิริ...มาตลอดคะ

*^__^*

กะปุ๋ม

[ศิริ]

ตามมาเก็บรอยคุณ Ka-poom ค่ะ ทิ้งรอยไว้เยอะมากน๊ะค๊ะ (แบบนี้ ขอบอกว่าเป็นผู้ร้ายไม่ได้เด็ดขาด)

[yothin]

อยากสอบถามว่ามีการวิเคราะห์แอมโมเนียในอาหารหรือป่าวครับ 

เนื่องจากผมมีงานทดลอง 1ชิ้น พบว่ามีกลิ่นแอมโมเนียอยู่ จึงอยากทราบว่ามีปริมาณเท่าไหร่(ตัวเลข)จะมีวิธีวิเคราะห์หรือป่าวครับ

[yothin]

เพิ่มเติม อยากทราบแหล่งที่รับ วิเคราะห์แอมโมเนีย ด้วยอ่ะครับ 

 

ขอบคุณสำหรับคำตอบครับ

[OldLek]

แล้วตอนนี้ ถ้าจำทำงานวิจัย แนะนำให้ใช้วิธีไหนครับ คุณศิริ ( เหมือนถาม IPhone) เลย