วิธีการศึกษาคาริโอไทป์ของพืช
1.
การเพาะรากและการตัดปลายราก
นำพืชที่ต้องการศึกษามาปลูกในกระถางที่มีดินร่วนผสมทรายอัตราส่วน
2 : 1 เพื่อให้รากงอกใหม่ รดน้ำ 3 วันต่อ 1 ครั้ง
เพราะถ้ารดน้ำมากเกินไปอาจทำให้รากเน่าได้ ทิ้งไว้ประมาณ 2-3
สัปดาห์แล้วจึงทำการเก็บราก โดยขุดต้นพืชจากกระถาง
ระวังอย่าให้รากขาด
ล้างน้ำให้รากสะอาดหลังจากนั้นใช้ปากคีบตัดรากที่มีลักษณะขาวขุ่นยาวประมาณ
1-2 ซม. ซึ่งระยะเวลาที่ใช้ในการเก็บรากคือเวลา 9.00 น. – 12.00
น. และการเก็บรากแต่ละครั้งจะทิ้งระยะห่างเป็นเวลา 2
สัปดาห์
2.
การศึกษาจำนวนโครโมโซมจากปลายรากและคาริโอไทป์
การศึกษาโครโมโซมในเซลล์ร่างกายของปลายรากโดยเตรียมสไลด์แบบ
Feulgen squash ซึ่งมีขั้นตอนต่าง ๆ ดังนี้ คือ
2.1
การหยุดวงชีพเซลล์ (pretreatment)
นำชิ้นส่วนเนื้อเยื่อปลายรากที่มีลักษณะขาวใส
ปลายขุ่นเล็กน้อย ตัดรากยาวประมาณ 1-2 ซม.
แช่ในสารละลายอิ่มตัว Paradichlorobenzene (PDB)
ที่อุณหภูมิตู้เย็นประมาณ 10°C เป็นเวลานาน 4-6 ชั่วโมง
สารเคมีดังกล่าวจะช่วยหยุดวงชีพเซลล์และช่วยให้โครโมโซมขดตัวได้ดี
สะดวกในการนับจำนวนโครโมโซม
2.2
การหยุดการทำงานของเซลล์ (fixation)
นำรากที่เตรียมไว้ในข้อ
2.1 มาเทสารละลายทิ้ง แล้วใส่น้ำยาฟิกส์ราก
สารเคมีที่ใช้คือ สารละลายคาร์นอย (Carnoy’s solution)
เตรียมจาก 3 absolute ethanol : 1 glacial acetic acid
แช่รากทิ้งไว้ที่อุณหภูมิตู้เย็นคือประมาณ 10°C เป็นเวลา 24
ชั่วโมง
สารละลายคาร์นอยนี้จะทำให้เซลล์หยุดอยู่ในระยะที่ต้องการ
สามารถรักษารูปร่างและส่วนประกอบของเซลล์ให้คงรูปเดิมอยู่ได้
และการที่สารละลายดังกล่าวมีคุณสมบัติของกรดทำให้นิวคลีโอโปรตีนไม่ตกตะกอนและไม่ละลายโปรตีนที่อยู่ในไซโทพลาสซึม
2.3 การเก็บรักษาเนื้อเยื่อ (storage)
นำรากในข้อ 2.2
มาล้างด้วย Ethyl alcohol 95% 2 ครั้ง
เพื่อล้างเอา glacial acetic acid ออกให้หมดก่อน
แล้วจึงเก็บเนื้อเยื่อไว้ใน Ethyl alcohol 70%
ที่อุณหภูมิตู้เย็น เก็บไว้ได้นานตามต้องการ (ประมาณ 6-12
เดือน) โดยไม่ทำให้เซลล์เหี่ยวหรือเสียน้ำ
เมื่อต้องการศึกษาโครโมโซมจึงนำรากที่เก็บไว้มาทำการทดลองต่อไป
2.4 การไฮโดรไลซิส
(hydrolysis)
นำเนื้อเยื่อที่เก็บไว้ในแอลกอฮอล์มาล้างให้สะอาด
ถ้ามีแอลกอฮอล์เหลืออยู่จะทำให้โครโมโซมไม่ติดสีย้อม
ในการไฮโดรไลซิสใช้ กรดเกลือเข้มข้น 1 นอร์มัล (1 N HCL)
ละลายผนังเซลล์ middle lamella โดยอุ่นให้ร้อนถึง 60°C นาน 4
นาที ขั้นตอนนี้จะช่วยให้รากอ่อนนุ่ม
ง่ายต่อการเคาะ ทำให้เซลล์กระจายตัวและโครโมโซมติดสีได้ดี
2.5 การย้อมสีโครโมโซมและการเตรียมสไลด์
(staining-Feulgen squash)
หลังจากไฮโดรไลซิสแล้ว
นำรากมาล้างด้วยน้ำกลั่น 2 ครั้ง
ซับด้วยกระดาษทิชชู่แล้วจึงนำมาย้อมสีด้วย Carbol fuchsin
นานประมาณ 2-4 ชั่วโมง
ตัดปลายรากเฉพาะส่วนที่ติดสีม่วงแดงซึ่งประกอบด้วยเนื้อเยื่อเจริญวางบนสไลด์
หยดสี Carbol fuchsin 1-2 หยด
ปิดด้วยแผ่นแก้วปิดสไลด์
แล้วเคาะปลายรากด้วยปลายดินสอให้เซลล์กระจายดี
หลังจากนั้นใช้หัวแม่มือกดทับบนสไลด์เพื่อให้โครโมโซมอยู่ในระนาบเดียวกัน(Bregman,
1996)
นำสไลด์มาตรวจดูด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงใช้เลนส์ใกล้วัตถุกำลังขยาย
40 เท่า
เลือกเซลล์ในระยะเมทาเฟสที่มีโครโมโซมกระจายตัวไม่ซ้อนกัน
นับจำนวนโครโมโซมด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงใช้เลนส์ใกล้วัตถุกำลังขยาย
100 เท่า อย่างน้อย 10 เซลล์
นำเซลล์ดังกล่าวไปถ่ายภาพจากกล้องจุลทรรศน์ใช้กำลังขยายของเลนส์ใกล้วัตถุ
100 เท่า

ครูอ้อยมาเรียนรู้แล้วนะคะ ขอบคุณมากค่ะ
รบกวนสอบถามครับ คือว่าผมสงสัยว่าทำไมเราเก็บตัวอย่างด้วยการแช่แอลกอฮอล์ 70% ด้วยครับ เราสามารถแช่ที่ความเข้มข้นมากกว่าหรือน้อยกว่า 70% ได้ไหมครับ
ด้วยความเคารพครับ
ขอบคุณมากครับ
ตอบคุณปลาโอค่ะ..ขอโทษที่ตอบช้าไปหน่อยนะคะ
การที่ต้องแช่ตัวอย่างในแอลกอฮอล์ 70% ก็เพื่อรักษาสภาพของเซลล์ไว้ให้ใกล้เคียงของเดิมมากที่สุดค่ะ เซลล์จะไม่สูญเสียน้ำค่ะ
ส่วน..จะแช่ในความเข้มข้นอื่นได้หรือไม่นั้น ก็ต้องทดลองดูค่ะ เพราะยังไม่เคยทดลองเช่นกัน แต่คิดว่า..ถ้าความเข้มข้นมากอาจจะทำให้เซลล์เหี่ยวได้ค่ะ แต่ถ้าความเข้มข้นมาก..เซลล์พืชคงแตกยากค่ะ
ขอโทษค่ะ..พิมพ์ผิดนิดหนึ่ง
หมายถึง ถ้าความเข้มข้นของแอลกอฮอล์น้อย เซลล์พืชคงแตกได้ยากค่ะ เพราะมีผนังเซลล์อยู่ค่ะ
อยากทราบว่าการศึกษาคาริโอไทป์ของพืชเราใช่สาวนใดได้อีกบ้างค่ะ นอกจากราก
เรียนรู้แล้วขอบคุงคร้า
ตามปกติแล้วการศึกษาโครโมโซมจะศึกษาในเซลล์ที่เป็นเนื้อเยื่อเจริญค่ะ..บริเวณที่ศึกษากันเยอะ ก็ได้แก่ ปลายยอด และปลายราก แต่การศึกษาคาริโอไทป์จะนิยมศึกษากันในเซลล์ปลายรากมากกว่า เนื่องจากรากมีลักษณะใส สามารถสังเกตเซลล์เนื้อเยื่อเจริญได้ง่าย และที่สำคัญสามารถเลี้ยงรากได้ง่ายด้วยค่ะ..
ขอบคุณทุกท่านค่ะ..ที่เข้ามาเรียนรู้
หนู อยากทราบว่า การศึกษาโครโมโซมข้าวโพด โดยใช้ส่วนดอกในการศึกษา จะทำได้ไหมค่ะ และมีวิธีการศึกษาที่ยากหรือป่าว ตอบให้หนูด้วยนะค่ะ ขอบคุนล่วงหน้าค่ะ