การ สรุปผลเช่นนี้ทำให้ผลงานของเขาไม่ได้รับความสนใจ ทั้งๆที่การศึกษาของเขาสามารถจัดได้ว่าเป็นการค้นพบไวรัสเป็นคนแรก ตรงนี้ให้ข้อคิดว่า ถ้าการศึกษาทดลองไม่ได้พิสูจน์ชัดเจนว่าสิ่งมีชีวิตนั้นเป็นแบคทีเรียจริงๆ ควรที่จะสรุปผลเป็นแบบปลายเปิด ที่รวมความเป็นไปได้ต่างๆที่สามารถคิดได้ไว้

ปาฐกถารางวัล โนเบิล

เรื่อง การแยกและศึกษาคุณสมบัติ (Isolation and Properties) ของผลึกไวรัสใบด่างยาสูบ (crystalline Tobacco Mosaic Virus) [4] 

ปี ค.ศ. 1892 อยู่ในช่วงที่มีความเชื่อโดยทั่วไปว่าโรคติดเชื้อต่างๆเกิดจากแบคทีเรีย มีผลทำให้ นาย Iwanowsky สรุปว่าน้ำจากต้นยาสูบที่เป็นโรค ทำให้เกิดโรคใบด่างยาสูบ โดยแบคทีเรียมีขนาดที่สามารถผ่านการกรองได้ ซึ่งในขณะนั้นสิ่งมีชีวิตขนาดเล็กที่รู้จักไม่สามารถผ่านการกรองได้ (การสรุปผลเช่นนี้ทำให้ผลงานของเขาไม่ได้รับความสนใจ ทั้งๆที่การศึกษาของเขาสามารถจัดได้ว่าเป็นการค้นพบไวรัสเป็นคนแรก ตรงนี้ให้ข้อคิดว่า ถ้าผลการศึกษาทดลองไม่ได้พิสูจน์ชี้ชัดเจนว่าสิ่งมีชีวิตนั้นเป็นแบคทีเรียจริงๆ ควรที่จะสรุปผลเป็นแบบปลายเปิด ที่รวมความเป็นไปได้ต่างๆที่สามารถคิดได้ไว้)

ต่อมา Beijerinck (1898) สนใจ จึงทำการทดลองซ้ำและเพิ่มวิธีการศึกษามากขึ้น เขาเห็นความสำคัญของผลการทดลอง และเขาเชื่อว่าไม่ใช่พวกแบคทีเรีย แต่เป็นสิ่งมีชีวิตก่อโรคอีกชนิดหนึ่ง จึงเรียกว่า contagium vivum fluidum หมายถึง ของเหลวที่มีสิ่งมีชีวิตก่อโรค (อันนี้ เป็นการชี้ให้เห็นว่า มีเชื้อก่อโรคอีกกลุ่ม ซึ่งไม่ใช่แบคทีเรีย) ซึ่งหลังจากการศึกษานี้นั้นได้นำไปสู่การค้นพบไวรัสแตกต่างกันต่อมามากกว่า 300 ชนิด ที่เป็นสาเหตุของโรคในคน สัตว์และพืช

ไวรัสก่อโรคในคน จะรวมไวรัส smallpox, yellow fever, dengue fever, poliomyelitis, encephalitis, measles, influenza, pneumonia, common cold

ไวรัสของของสัตว์ เช่น hog cholera,cattle plague, fmd, horse swamp fever, equine encephalitis, rabies, fowl pox, Newcastle, fowl paralysis, benign tumour และmalignant tumour ของ rabbits และ mice.

ไวรัสของพืช เช่น TMV, peach yellows, aster yellows, potato yellow dwarf, alfalfa mosaic, curly top of sugar beets, tomato spotted wilt, tomato bushy stunt, corn mosaic, cucumber mosaic, sugar cane yellow stripe

ต่อมา Elford (1930) ได้ใช้แผ่นกรองที่มีขนาดรูกรองแตกต่างกัน แสดงให้เห็นว่า "ไวรัสอาจใหญ่ถึง 300 นาโนเตร (ขณะนั้นใช้คำว่า มิลลิไมโครเมตร mμ) และเล็กถึง 10 mμ " แต่เนื่องจากยังไม่ทราบว่าไวรัสนี้มีเมตาบอลิซึมหรือไม่อย่างไร จึงเกิดมีข้อสงสัยว่าถ้ามีเมตาบอลิสมเหมือนๆกับเซลล์ทั่วไปจะบรรจุองค์ประกอบต่างๆในกระบวนนี้เข้าไปได้อย่างไร (ดูภาพ)

ไวรัสยังมีขนาดแตกต่างกันมาก ไวรัสขนาดใหญ่ๆจะใหญ่กว่า จุลินทรีย์ที่อาศัยอิสระ (pleuropneumonia) ส่วนไวรัสที่มีขนาดเล็กขนาดเล็กๆจะเล็กกว่าโมเลกุลขนาดใหญ่

ในเวลานั้น คุณลักษณะของไวรัสยังคงเป็นสิ่งที่ลึกลับ ยังไม่มีใครรู้องค์ประกอบทางเคมีของไวรัส การใช้ไวรัส TMV ในการศึกษานั้นมีข้อดี คือผลิตได้ปริมาณมากและมีความคงทนเป็นพิเศษ

สิ่งที่ศึกษาตอนแรก เป็นการศึกษาทางเคมีของไวรัส TMV ประกอบด้วยหัวข้อย่อย คือ ผลของทริพซิน การย่อยด้วยเพพซิน อัตราการเสียสภาพที่ pH ต่างๆ (ภาพที่ 2) ผลของสารเคมีต่างๆต่อความสามารถติดเชื้อ การหาค่า pH ที่เหมาะสมสำหรับการทำให้ไวรัสบริสุทธิ์ด้วย lead acetate

การศึกษาผลของทริพซิน พบว่าไม่ได้เกิดจากฤทธิ์ย่อย การให้ความร้อน การเจือจางและการแยกเอาทริพซินออกไป ไวรัสกลับเป็นปกติสามารถติดเชื้อได้ ซึ่งผลจะเหมือนกับการเติมโปรตีนที่มีค่า isoelectric point >pH 7 เช่น ทริพซิโนเจน หรือโกลบิน ดังนั้นการศึกษาด้วยทริพซินไม่ได้ให้ข้อมูลเกี่ยวกับไวรัส ในขณะที่เมื่อใช้เอ็นไซม์เปบซิน สามารถย่อยไวรัสจนเสียสภาพจนไม่สามารถคืนสภาพได้ ดังนั้นไวรัสน่าจะเป็นเป็นโปรตีนหรือจับอยู่กับโปรตีน

ไวรัสมีความคงตัวระหว่าง pH3-8 ค่อนข้างคงตัวระหว่าง pH1.5-2.5 และ pH8-9

จากการทดสอบด้วยสารเคมีต่างๆ พบว่าสารเคมีที่ทำให้ไวรัสเสื่อมสภาพ คือ สารออกซิไดซ์ สารตกตะกอนโปรตีน สารทำให้เกิดไอออนของไฮโดรเจน

โดยการใช้ค่า pH ที่แตกต่างกัน ทำให้สามารถใช้ lead acetate ในการตกตะกอนและแยกไวรัสบริสุทธิ์ออกได้ วิธีการทำดังนี้ ปลูกต้นใบยาสูบ พอมีขนาดสูง 3-4 นิ้ว ก็ใช้ผ้าก็อซพันแผลชุบไวรัสแล้วนำไปขัดที่ใบยาสูบ 1-2 ใบ หลังจากนั้นปล่อยไว้ 2-3 สัปดาห์ (ไม่เกิน 4 สัปดาห์) ตัดแล้วนำไปแช่แข็ง เมื่อแข็งแล้วนำไปบดด้วยเครื่องบดเนื้อ จากนั้นปล่อยให้ละลาย นำไปคั้นน้ำ ขั้นตอนต่างๆทำในห้องเย็น ภาชนะ สารต่างๆ ที่ใช้ ให้มีอุณหภูมิที่ 4 องศา จากนั้นใช้ 0.1-1 N. NaOH ปรับ pH เป็น 7.2+/-0.2 จากนั้นเป็น 6.7+/- 0.2 (โดยผสมกับ press cake และคั้นอีกครั้ง หรือเติม disodium phosphate) จากนั้นกรองด้วย ซีไรท์ (celite) ต่อไปแยกส่วนของโกลบูลินออกโดยตกตะกอนด้วย แอมโมเนียม ซัลเฟต 30 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นละลายตะกอนกลับ ทำการตกตะกอนซ้ำด้วยแอมโมเนียม ซัลเฟต 2-3 ครั้ง สิ่งที่กรองได้จะไม่มีสี ตะกอนที่ได้จะมีสีเล็กน้อย ถ้ายังมีสีมากอาจใช้ lead subacetate ช่วยตกตะกอน แล้วกรองด้วยซีไรต์ จากนั้นกระจายซีไรต์ในน้ำ ปรับ pH เป็น 7 แล้วกรอง สิ่งที่กรองได้ขุ่น (opalescent) ไม่มีสี จะมีไวรัส 80 เปอร์เซ็นต์ของปริมาณไวรัสเริ่มต้น

การตกผลึกสิ่งที่กรองได้ จะใช้ ammonium sulfate, และ glacial acetic acid จากนั้นพิสูจน์ว่า ผลึกนี้คือ TMV พบว่ามีไวรัสมากกว่าเริ่มต้น 500 เท่า ในปริมาณเจือจาง 10-9กรัมต่อมล. หรือกรณีที่ภาวะเหมาะสม 10-14 กรัมต่อ มล. ก็สามารถก่อโรค การศึกษาทางกายภาพ เคมี และชีวภาพ จนในที่สุดสามารถสรุปได้ว่า ผลึกนี้คือไวรัส TMV

ต่อมาปี 1936 Pirie และคณะสามารถแยก กรดนิวคลิอิกจากผลึกเหล่านี้ และสรุปในปี 1937ว่าผลึกไวรัสนั้นเป็น นิวคลีโอโปรตีน ซึ่งไม่มีใครเชื่อทันที จนกระทั่งต่อมาพบว่า จะไม่สามารถแยกกรดนิวคลิอิกนี้ได้เลยถ้าไม่ทำให้ไวรัสเสียสภาพหรือหมดฤทธิ์ก่อน (คือทั้งโปรตีนและกรดนิวคลิอิกจับกันเป็นโครงสร้างของไวรัสที่ติดเชื้อได้)

เขาได้หาส่วนประกอบกรดอะมิโนของ TMV กับอีก 8 สายพันธุ์ พบว่าบางสายพันธุ์มีกรดอะมิโนบางชนิดแตกต่างจาก TMV อย่างมีนัยสำคัญ และมักไม่มี methionine, histidine และ cystine

  • โดยอาศัยทฤษฎีทางฟิสิกส์เคมี ประมาณว่า TMV มีเส้นผ่าศูนย์กลาง 12 มิลลิไมครอน ยาวประมาณ 400 มิลลิไมครอน มีน้ำหนักโมเลกุล 40 ล้าน
  • ผลจากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนทั้งในเยอรมันและที่ห้องปฏิบัติการ พบว่ามีขนาด 15x 280 มิลลิไมครอน และ
  • ผลจากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน 3 แห่งของโลก พบว่า มักมีขนาด 280 +/- 8.6 มิลลิไมครอน
  • ดังนั้นการศึกษาทางเคมีฟิสิกส์และคุณสมบัติทางแสง ได้ขนาดและรูปร่างที่สอดคล้องกัน

การที่ไวรัสมีน้ำหนักโมเลกุลสูง การมีเครื่องปั่นเหวี่ยงความเร็วสูง วิธีทางกายภาพที่ใช้ differential centrifugation ก็ใช้มากขึ้นในการแยกไวรัสให้บริสุทธิ์และเข้มข้น

ไวรัส TMV สามารถต่อปลายกับปลายได้ บางส่วนก็แยกได้ บางส่วนก็แยกไม่ได้ ขึ้นกับภาวะที่ไวรัสจับกันตอนแรก

มีการแยกไวรัสต่างๆ ให้บริสุทธิ์รวม 8 ชนิด พร้อมหาภาพจากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน

ไวรัส tomato bushy stunt virus เป็นผลึกเหลี่ยม ดูภาพ

(ยังไม่เสร็จ)

 

 

เอกสารอ้างอิง

http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1946/stanley-lecture.pdf

ปาฐกถา

โดย Wendell M. Stanley (Chemistry 1946) = Wendell Meredith Stanley

 

มีชีวิตระหว่าง 1904 - 1971 รวม 66 ปี จบปริญญาเอกทางเคมี เป็นศาสตราจารย์ทางชีวเคมี และผู้อำนวยการห้องปฏิบัติการไวรัส ต่อมาเป็น ศาสตราจารย์ทางไวรัสวิทยา สามารถแยก nucleoprotein ของไวรัสใบด่างยาสูบ ได้รับรางวัลโนเบิลสาขาเคมีในปี 1946 สำหรับการเตรียมเอ็นไซม์และโปรตีนบริสุทธิ์ของไวรัส (ร่วมกับ prize co-recipient: John Howard Northrop ref=3)