บันทึกจากแดนซากุระ 15 : จากการฝึกงานมาเป็น 1 บทความวิจัย

เบื้องหลังความคิดคน ที่วางแผนให้ผมฝึกงานไปจนกระทั่งเขียนบทความวิจัย ตั้งแต่ก่อนที่ผมจะมาญี่ปุ่นด้วยซ้ำ

     กลับมาสู่การบันทึกความรู้ที่ได้จากการฝึกงานบ้าง หลังจากห่างหายไปนานพอสมควร บันทึกนี้ขอเล่าถึงการแปลงงานที่เราฝึกทำอยู่ไปเป็นงานวิจัย

     ความที่ผมไม่มีพื้นฐานงานด้าน molecular เลย แล้วต้องมาทำวิทยานิพนธ์ในเรื่องที่เกี่ยวข้องกับงาน molecular ก็เป็นธรรมดาที่จะต้องฝึกต้องทำให้พอรู้เรื่องก่อนแล้วค่อยเริ่มงานวิจัย ผมก็เข้าใจมาตั้งแต่ต้นว่ายังไงก็ต้องฝึก ก็ต้องเรียนรู้ แต่ sensei วางแผนไว้ลึกกว่านั้นเยอะ

     ความเข้าใจแต่เดิมเนื่องจากยังไม่ได้มีการคุยรายละเอียดมากนัก ผมรู้แต่เพียงว่างานวิจัยที่ผมจะใช้ submit ปริญญาเอกนั้นเป็นเรื่องการศึกษา mitochondia ในชนกลุ่มน้อยของประเทศไทย ทีนี่ก็เป็นเรื่องที่ผมต้องเรียนรู้เทคนิคที่เกี่ยวข้อง  sensei ก็ให้นักศึกษาปริญญาโทคนหนึ่งเป็นคนสอนเทคนิคการสกัด DNA โดยใช้ NaI protocol ตามที่เคยเล่าให้ฟังไปแล้ว หลังจากนั้น sensei ก็สอนเทคนิคการทำ PCR และ PCR RFLP ให้ผมด้วยตัวเอง โดยให้ทดลอง amplify p53 codon 72 ซึ่งอยู่บริเวณ exon 4 ของ p53 ได้ pcr product ขนาด 203 bp แล้วเอามาตัดด้วย restriction enzyme Bst UI ซึ่งจะตัดบริเวณ CG/CG ตรง codon72 ได้เป็น 2 fragments ขนาด 125 และ 78 bp ถ้าตัดได้แสดงว่าตรง codon 72 เป็น Arginine ถ้าตัดไม่ได้ก็เป็น Proline คำว่าทดลองทำ หรือฝึกให้ทำนี่มันก็ควรเป็นตัวอย่างตรวจไม่มาก ก็ทำให้มันรู้ว่าเป็นอย่างไร แต่มันก็ไม่เป็นไปตามที่ผมคิด แกส่ง sample ให้ผมทั้งหมด มากกว่า 3 กล่อง รวมหมดแล้ว 346 ตัวอย่าง ก็ทำมันให้หมดนี่แหละ ทำครั้งสองครั้งอาจจะไม่เจอปัญหาทั้งหมด ทำทั้งหมดนี่ก็คงไม่เจอปัญหาทั้งหมด แต่มันต้องเจอบ้าง แล้วก็จะรู้วิธีแก้ปัญหาไปเอง  ซึ่งก็ได้ผลครับ ผมเองเข้าใจดีว่ากำลังอยู่ในขั้นตอนการเรียนรู้ ผมมีเวลาเต็มที่เพราะเพิ่งเริ่มเรียนเป็นปีแรก เราไม่มีความจำเป็นต้องรีบร้อน ตัวอย่าง 346 ตัวอย่าง ถ้าเราเตรียมวิธีการของเราได้ดีแล้ว จะทำดีเดียวตูม เสร็จก็ไม่ใช่เรื่องยาก แต่ทำอย่างนั้นแล้วจะได้ประโยชน์อะไร หากเราต้องการเรียนรู้เทคนิค เราก็ควรจะฝึกทำให้มากที่สุด ผมก็เลยแบ่งตัวอย่างตรวจมาฝึกทำคราวละ 24 ตัวอย่าง ค่อยๆทำไปเรื่อยๆ ไม่ได้รีบร้อนอะไร หลายคนก็แปลกใจทำไมผมทำครั้งละไม่มาก นี่เป็นเหตุผลของผมครับ ผมใช้เวลาอยู่ ประมาณ 1 เดือนเต็มในการสกัด DNA ทำ pcr และ ตัดด้วย RE ซึ่งช้ากว่าที่ sensei คาดไว้ แต่ผมก็รู้ตัวว่าทำอะไรอยู่ มีปัญหาเชิงเทคนิคหลายอย่าง แล้ววันหลังจะเล่าให้ฟังครับ หลังจากที่ส่งผลให้ sensei ดู แกก็ให้ผมกลับมาวิเคราะห์ว่าผลเป็นอย่างไรบ้าง ให้หนังสือเรื่อง population genetics มาให้อ่าน 1 เล่ม ให้ตายเถอะครับ ให้คนทางด้าน medical มาอ่านหนังสือด้าน anthropology แล้วที่สำคัญเป็นหนังสือวิเคราะห์สถิติครับ ผมทุรนทุรายอ่านสักพักก็บอกกับตัวเองว่า ไม่รู้เรื่องครับ เหมือนกับงมเข็มในมหาสมุทร ไม่รู้ว่าจะทำอะไร ผมก็เปลี่ยนวิธีการใหม่ คือ

    1. กลับไปหา annual report ของที่นี่ย้อนหลังกลับไป 3 ปี ว่าที่นี่มีงานวิจัยอะไรบ้าง แน่นอนเป็นงานวิจัยของ sensei แน่ คนเราเดินไปทางไหนย่อมทิ้งรอยเท้าไว้เป็นทาง ฉันใด งานวิจัยของแก ก็ย่อมทิ้งแนวทางวิจัยของแกไว้ ไม่ต่างกัน ผมเริ่มอ่านงานของแกทีละชิ้น ที่ละชิ้น จนพอจะเริ่มเข้าใจว่า งานประเภทที่เราทำอยู่นั้นควรจะวิเคราะห์ด้วยสถิติตัวไหน และมีแนวทางในการนำเสนอข้อมูลอย่างไร อีกทั้งมีประเด็นไหนใช้ในการเขียน discussion ได้

     2. นิสัยคนไทย อย่างเรา ให้กลับไปนั่งอ่านเองนะเหรอ ไม่มีทาง ผมเลือกใช้วิธีการถามดีกว่า แล้วคนที่ผมเลือกที่จะถามก็คือ Kashima สาวน้อยผู้ที่เคยไปอยู่หาดใหญ่หลายครั้งและผมก็มีความสนิทสนมเป็นการส่วนตัว ไอ้ที่เขาจะปฏิเสธเราถ้าประเมินจากนิสัยของเขาแล้ว โอกาสน้อยมาก ซึ่งผมก็คิดถูก Kashima อธิบายให้ผมฟังว่า ในการนำเสนอข้อมูลนอกจากนำเสนอเรื่องของ allele frequency และ genotype distribution แล้ว ยังต้องเปรียบเทียบ chi square ด้วยว่า population ของเราอยู่ใน Hardy-Weinberge equilibrium หรือเปล่า อ้าวข้อมูล chi square มันต้องเปรียบเทียบคนสองกลุ่มนี่นะ นี่มีคนแค่กลุ่มเดียวมันจะเทียบกับอะไร สาวน้อยร้อยชั่งก็เล่าต่อไปว่า ก็คำนวณค่าคาดหวังขึ้นมา แล้วก็เอาค่าที่เราทำแล็บได้มาเทียบกับค่าคาดหวัง ก็จะออกมาว่ามีค่า chi square เท่าไหร แล้วคำนวณค่า p-value ว่ามีความแตกต่างทางสถิติหรือไม่ พร้อมทั้งบอกว่าการคำนวณ chi square ก็ให้ไปที่ web site แล้วให้ใส่ค่าต่างๆ เข้าไป เครื่องก็จะคำนวณออกมาได้ ผมก็ลองใส่ค่าต่างๆ เข้าไป แล้วก็ print out ออกมาสบายใจเฉิบ  แต่เท่านั้นไม่พอครับ ผมกลับไปนั่งอ่านหนังสือในบทที่เกี่ยวข้องกับ Hardy-Wienberge Equilibrium เอ! มันน่าแปลกใจทำไมคราวนี้อ่านรู้เรื่องแล้วนะ แต่เท่านั้นก็ยังไม่พอ จะให้เชื่อค่าต่างๆ ที่เครื่องมันคำนวณออกมาได้อย่างไร ถ้าเครื่องมันคำนวณผิดล่ะ อย่ากระนั้นเลย เราก็ต้องหาสูตรต่างๆ ที่ใช้ในการคำนวณซึ่งก็มีอยู่ในหนังสืออยู่แล้ว ลองเอามาคำนวณใน excel ดูว่าค่าต่างๆ ที่เครื่องแสดงมันถูกต้องไหม แล้วทำให้เราได้รู้ที่มาของค่าต่างๆ ที่นำมาใช้การการคำนวณตลอดจนวิธีการคำนวณมากขึ้น

     ได้ผลครับ ภายในคืนเดียวผมสามารถคำนวณทุกอย่างที่เกี่ยวข้องออกมาเสร็จ พร้อมทั้งบอกที่มาของค่าต่างๆได้ ว่าค่าไหนคำนวณอย่างไร แล้วมันหมายความว่าอย่างไร พอส่งให้ sensei แกก็ยิ้มอย่างพอใจแล้วก็บอกว่า เอาข้อมูลนี่ไปเพิ่มแล้วก็ไปคำนวณมาใหม่ ข้อมูลที่ให้มาเป็นข้อมูลว่าตัวอย่างตรวจที่เราตรวจไปนั้น มีใครเป็นชนกลุ่มน้อยเผ่าไหนบ้าง ซึ่งก็มีอยู่หลายเผ่า เช่น Moken, Urak Lawoi, Thai, Malay, Pakistan, Burmese, และเผ่าผสมซึ่งมีตั้งแต่ 2 เผ่าไปจนถึง 4 เผ่า ก็ให้มาแยกเอง ว่าควรจะแบ่งออกเป็นกี่กลุ่มแล้วให้เปรียบเทียบว่าแต่ละกลุ่มมี genotype distribution แตกต่างกันหรือไม่ แล้วบอกให้เขียนเป็น manuscript ด้วยเพื่อส่งตีพิมพ์ ผมถามว่าจะส่งตีพิมพ์ Journal ไหนจะได้จัด format ให้ถูกต้องตามที่ journal นั้นต้องการ แกก็ไม่ตอบว่าจะให้ลงที่ไหน เอาล่ะงานเฉพาะหน้าของเราตรงนี้ ก็ไปแบ่งกลุ่มแล้วคำนวณค่า chi squre เทียบละหว่างกลุ่มออกมาว่า แต่ละกลุ่มมันมีความแตกต่างของ genotype distribution หรือไม่ กลุ่มไหนที่ไม่แตกต่างกัน ก็จับมารวมกัน จนแบ่งออกมาได้เป็น 5 กลุ่มดังนี้ Moken, Urak Lawoi, Thai, More than 1 ethnic background group, และ other แล้วคำนวณค่า chi square ออกมาพบว่า Moken เป็นเพียงกลุ่มเดียวที่มี genotype distribution แตกต่างจาก Urak Lawoi และ Thai   จากงานนี้ก็เลยทำให้ได้รู้ว่ามี web site อื่นที่ยังใช้คำนวณ ค่า chi square ได้และเปิดโอกาสให้เราใส่ค่าตารางได้มากกว่า web site แรก สุดท้ายก็ใช้ website ตัวหลังนี่แหละครับในการคำนวณ แล้วก็พบว่าค่า interpretation ของ website หลังนี่เชื่อไม่ได้นะครับ (แปลผลว่า significant หรือไม่) ส่วนค่าอื่นๆ ใช้ได้ครับ  ถ้าเราไม่ตรวจสอบให้ดีตั้งแต่ต้น เชื่อได้เลยครับว่าเละเทะหมดแน่ โชคดีที่ผมศึกษาวิธีการคำนวณแล้วสอบเทียบกลับไปหลายๆ ตัวอย่างจึงพบว่ามีบางตัวอย่างการแปลผลของ website หลังผิดพลาด แต่website หลังนี้มีความยืดหยุ่นกว่าและช่วยให้เราวิเคราะห์ผลได้สะดวกกว่า website แรกครับ หลังจากที่ได้คุยกับ sensei เรื่องผลการวิเคราะห์ทั้งหมดและหาดูว่ามีประเด็นอะไรบ้างที่น่าจะใช้ในการเขียน discussion ได้ ผมก็เริ่มกลับมาเขียน manuscript แล้วความที่เราไม่รู้ว่าจะต้องเขียนลง journal อะไร ทำให้ผมต้องเริ่มเรียนรู้การใช้โปรแกรม endnote เป็น reference manager ในการเขียนบทความทางวิชาการ ปกติบทความที่ผมเขียนผมไม่เคย link กับ endnote ครับแม้ว่าจะทราบว่า endnote เป็นโปรแกรมจัดการด้าน reference manager ที่ดีมากตัวหนึ่ง ทั่วไปแล้วใช้แต่ search หา paper ที่เกี่ยวข้องแล้วรวบรวมเป็น library ครับ คราวนี้ก็เลยได้ลองใช้อีก function หนึ่งของ endnote ซึ่งก็ใช้ไม่ยากครับ สำหรับคนที่เขียนบทความทางวิชาการ ผมแนะนำนะครับว่าควรใช้ endnote จัดการด้าน reference ให้ครับ สุดท้ายผมใช้เวลาเขียน manuscript เสร็จใน 2 วัน (เสาร์-อาทิตย์) แล้วแกล้งทำเป็นลืม บทความให้สนิท เรื่องนี้ผมมีความสามารถครับ เพราะผมลืมได้สนิทจริงๆ มีประวัติเคยลืมใครบางคนไว้ข้างหลังโดยไม่ไปรับมาแล้ว พอลืมได้แล้วเราก็ตรวจสอบอีกครั้งว่าบทความที่เราเขียนต้องแก้ไขตรงไหนบ้าง จนเสร็จแล้วก็ส่งให้ sensei ในวันจันทร์ เป็นการใช้เวลา 3 วันในการเขียน และประมาณ 4 วันในการวิเคราะห์ผลทั้งหมด หมดแล้วครับภาระของผม เพราะเมื่อผมเขียนเสร็จแล้วส่งให้ sensei เรื่องนี้ก็จะไปอยู่ในความรับผิดชอบของ sensei แทน แกอาจจะนั่งกุมขมับอยู่ครับว่า มันเขียนอะไรมาหว่า อ่านแล้วไม่เห็นจะเข้าใจ ตราบใดที่แกยังไม่โยนกลับมาให้ผม แล้วบอกว่าให้เอากลับไปเขียนใหม่เพราะอ่านไม่รู้เรื่องว่ะ ความรับผิดชอบเรื่องนี้ก็ไปอยู่ที่แกเสียแล้ว ส่วนผมก็หาเวลานอนตีพุง หาอะไรกินต่อไป ให้สบายใจดีกว่า

[ปารมี]

ยอดเยี่ยมมากค่ะ

[โอ๋-อโณ]

รู้สึกว่าเราจะเดินตามรอยเดียวกันเลยค่ะ แต่ sensei ของพี่ไม่ค่อยน่ารักเท่า พี่มีโปรแกรม Excel ที่ใช้สูตรคำนวณ genotyping frequency กับ Chi-square test พร้อมทั้งคำนวณ HDW ด้วย (แต่คิดว่าคุณ mitoฯ คงทำเช็คเองแล้วละมัง) พี่ทำขึ้นเองตามสูตรในตำรา ตั้งแต่สมัยยังไม่มี website ช่วยทำให้ เป็นแบบ primitive มากๆแต่ก็ทดสอบแล้วและใช้ได้ดี เวลาดูผลก็ตรวจเช็คได้ง่าย (สำหรับพี่เองคิดว่าอย่างนั้น ยังไม่เคยลองกับใคร) การที่ต้องทำและคิดอะไรๆเองก็ช่วยให้เราเข้าใจลึกซึ้งขึ้น ถ้าอยากเอาไปลองเช็คก็ส่งอีเมลมาบอกได้นะคะ (แต่คงไม่ต้องแล้วละมัง เพราะเขียนจนเสร็จแล้ว ส่วนมากถึงขั้นนี้แล้ว แทบจะเมินไม่มองแล้วไอ้ที่ต้องลุยมา)

[mitochondria]

ขอบคุณมากครับพี่โอ๋ สำหรับน้ำใจเล็กๆน้อยๆที่มอบให้ แต่ไม่ทันการณ์แล้วครับ ผมคำนวณเสร็จหมดแล้วครับ ซึ่งผมได้เขียนพื้นฐานวิธีคำนวณไว้แล้วในบทความถัดจากนี้ไป  ตอนนี้เริ่มต้นทำ amp mitochondria บริเวณ D-loop แล้วครับ เริ่มต้นก็ contaminate สวยเลยครับ Positive control ขึ้น band สวยขนาด 200 กว่า bp ตรงตามที่ต้องการ เจ้า Negative control ก็ไม่น้อยหน้ากัน ขึ้น band เดียวกันสวยเหมือนกัน ตอนนี้ก็กุมขมับปวดหัวกับมันอยู่ clean pipette ก็แล้ว, เปลี่ยน Buffer, dNTP, Mg, DDW, taq ก็แล้ว เหลือแต่ primer กับคนทำ กะว่าพรุ่งนี้จะส่ง primer ไปให้เจ้าม้อยช่วยทำโดยใช้น้ำยาของม้อยทุกอย่าง สงสัยจะเป็นเจ้า primer นี่แหละ ถ้าเป็นเจ้านี่จริงหลังจากม้อยพิสูจน์แล้ว ก็คงต้องสั่งซื้อของใหม่ มะรืนนี้ก็จะได้ลุยต่อครับ

[Handy]

สวัสดีครับ
   เห็นคำ ซากุระ  ก็เลยเข้ามา เพราะคิดถึง ซากุระ เหมือนกันครับ 18 เดือนเคยไปอยู่มา ได้รับหลายอย่างมีคุณค่า จากแดนอาทิตย์อุทัย
   แต่ พอมาถึงเรื่องที่ คุณน้อง โอ๋-อโณ comment .. แหะ ๆ ๆ ใบ้กิน ไม่อาจแสดงความเห็นครับ .. Jaa ma ta ne !