Protocol การทำความสะอาด sequencing reaction โดยการกรองแบบ plate

วิธีนี้ใช้หลักการในการกรองสารโมเลกุลเล็กออก ในขณะที่ DNA โมเลกุลใหญ่ไม่สามารถผ่านรูของ membrane ออกไปได้

 

ใช้ผลิตภัณฑ์ของ Millipore ชื่อ Montage SEQ 96 (Sequencing Reaction Cleanup Kit) มีลักษณะเป็น plate สีฟ้า ด้านล่างเป็น membrane มี 96 wells  Cat No LSKS09624 ในชุดมี 24 plate และมี injection solution  1 ขวด

วิธีการทำ

     1. ดูด injection solution 20 ul ผสมกับ PCR product ที่ผ่านการ amplify ด้วย BigDye แล้ว 10 ul ผสมให้เข้ากันโดยการดูดขึ้นลงด้วย autopipette ประมาณ 10 ครั้ง

     2. ดูดใส่ plate สีฟ้า

     3 นำไป suction ที่ความแรงประมาณ 10-20 in Hg ประมาณ 2-3 นาที จนแห้งสนิท แล้วใช้กระดาษทิชชูซับน้ำด้านล่างของ plate

     4. เติม injection solution 20 ul

     5. นำไป suction อีกครั้งให้แห้งสนิท

     6. เติม injection solution 20 ul แล้วใช้ autopipette ดูดขึ้นลง ประมาณ 20 ครั้ง

     7. ดูดถ่ายลงใน plate สำหรับนำไปเข้าเครื่อง sequencer