Basic Real-time PCR (6): ข้อดีและข้อด้อยของ Real-time PCR

  ติดต่อ

เว้นวรรคไปหลายวันมาต่อกันหน่อย จากเอกสารที่เขียนไว้เพื่อ การอบรมเชิงปฏิบัติการ Realtime PCR and its applications รู้ความแตกต่างของ Realtime PCR กับวิธีดั้งเดิมไปตอนที่แล้ว คราวนี้ก็มาดูข้อดีข้อด้อยของเขากันสักหน่อย


ข้อดีหลักของ Real-time PCR

    • สามารถติดตามผลได้ในขณะที่เกิดขึ้นจริง
    • ไม่ต้องมีขั้นตอนหลัง PCR ( ได้ผลลัพธ์มากขึ้น ลดโอกาสการปนเปื้อน)
    • การทำงานแต่ละรอบมักจะเร็วกว่าแบบธรรมดา
    • วัดได้มากขึ้นจนถึง 1010 เท่า ( wider dynamic range)
    • สามารถตรวจวัดความแตกต่างได้ถึงขั้นที่ต่างกันเพียง 1 เท่า
    • สามารถตรวจยืนยัน product ที่ได้โดยการวิเคราะห์ melting point
    • มีความจำเพาะสูงที่สุด ไวที่สุดและ reproducible ที่สุด
    • สำหรับงานทาง RNA จะใช้ปริมาณตั้งต้นของ RNA น้อยกว่าวิธีดั้งเดิมถึง 1000 เท่า
    • ค่าใช้จ่ายไม่ได้แพงกว่าการทำ PCR วิธีเดิม (ยกเว้นค่าเครื่องมือ)
  • ข้อด้อยของ Real-time PCR

ดาวน์โหลดเอกสารทั้งฉบับได้ตรงนี้เลยค่ะ Basic RealTime PCR

บันทึกนี้เขียนที่ GotoKnow โดย  ใน ประสบการณ์งาน Molecular มาแลกเปลี่ยน

หมายเลขบันทึก: 108702, เขียน: , แก้ไข, 2016-02-25 15:31:14+07:00 +07 Asia/Bangkok, สัญญาอนุญาต: สงวนสิทธิ์ทุกประการ, ความเห็น: 24, อ่าน: คลิก

คำสำคัญ (Tags) #basic#real-time pcr#basic real-time pcr

บันทึกที่เกี่ยวข้อง 
บันทึกล่าสุด 

ความเห็น (24)

fo
IP: xxx.151.232.70
เขียนเมื่อ 

สวัสดีค่ะ

อาจารย์ใช้ RT PCR ของยี่ห้ออะไรคะ

รัชนี
IP: xxx.132.3.12
เขียนเมื่อ 
สวัสดีค่ะ
   บังเอิญเข้ามาอ่านแล้วพบว่ามีประโยชน์   เลยคงต้องขอรบกวน  เพื่อขอรับคำแนะนำจากพี่โอ๋น่ะค่ะ  เพราะเป็นคนที่เพิ่มมาจับงานทางmolecularครั้งแรก โดยไม่ได้มีความรู้ทางนี้เลยและจะต้องทำงานโดยใช้ real time PCR เพื่อที่จะศึกษา SNP   รบกวนพี่โอ๋ช่วยให้คำแนะนำการนำ realtime มาใช้หา SNP ได้อย่างไร มีหลัการเป็นอย่างไรบ้าง ขอขอบคุณเป็นอย่างสูงค่ะ (ตอนแรกส่งmailมาแต่ไม่แน่ใจว่าพี่โอ๋จาได้รับรึเปล่า  เลยขออนุญาต post ในพื้นที่ตรงนี้น่ะค่ะ)
                                              รัชนี

ต้องขอโทษคุณ fo ที่ไม่ได้มาตอบเสียนานนะคะ ในงานที่ทำพี่โอ๋ทำนั้น ต้องวัดปริมาณ RNA ของ gene ถึง 5 ชนิดก็เลยทำ 2 step RT (Reverse transcriptase) นะคะ ได้ทดสอบ RT ของ 3 ยี่ห้อเท่านั้น แต่เห็นผลแตกต่างค่อนข้างชัดเจนนะคะในเครื่อง real-time ที่ใช้คือ The LightCycler และ Rotor gene อันที่ผลดีที่สุดที่พบคือ OmniScript ของ Qiagen ค่ะ

สำหรับคุณรัชนี ขอแนะนำให้อ่านทฤษฎีเบื้องต้นของเทคนิคนี้ที่พี่โอ๋เขียนไว้ แล้วทำความเข้าใจหลักการให้ดี แล้วขั้นต่อไปคือ หาดูจาก Literature review ว่า SNP ที่เราจะทำนั้น มีคนทำด้วย real-time PCR หรือยัง เขาใช้วิธีอะไร เพราะแต่ละ SNP ก็จะมีธรรมชาติของมันเอง ที่เราต้องทดลองดูเองว่าวิธีไหนจึงจะ work  ถ้ามีอะไรเพิ่มเติมที่อยากรู้ ลองเขียนถามมาได้นะคะ

พี...
IP: xxx.91.163.177
เขียนเมื่อ 

สวัสดีครับพี่ โอ๋-อโณ

        ผมชื่อพีครับ ผมเป็นเเฟนฺblog ตอบคำถามพี่โอ๋มานานเเล้ว ผมมีคำถามเกี่ยวกับ RDS-PCR มาให้พี่โอ๋ช่วยอธิบายถึงหลักการทำงานเเละการใช้ประโยชน์ที่ต่างจาก PCR ธรรมดายังไงครับ

                       ขอบคุณมากครับ

                             พี

ตอบน้องพีว่า เพิ่งเคยได้ยิน RDS-PCR เหมือนกันนะคะ ใส่ในพี่ Google แล้วถึงทราบมาจากเว็บ http://dnaresearch.oxfordjournals.org/cgi/content/full/dsm023v1 ว่ามาจากคำว่า Restriction Site-dependent PCR ใน paper ที่ลิงค์ไว้อธิบายค่อนข้างเข้าใจง่ายนะคะว่า คืออะไร ยังไง ว่าไปแล้ววิธีต่างๆที่ดัดแปลงเพิ่มเติมไปจากการทำ PCR ธรรมดานั้นมีมากมายเลยนะคะ เรียกได้ว่าขอให้คิดถึงหลักการของ PCR กับความรู้พื้นฐานเกี่ยวกับคุณสมบัติของ DNA เราก็สามารถจะดัดแปลง คิดวิธีในการสร้าง (amplify) ชิ้นส่วน DNA ที่เราต้องการได้อีกหลากหลายวิธีทีเดียวค่ะ
สุภาวดี-PSU(หาดใหญ่)
IP: xxx.12.73.5
เขียนเมื่อ 

สวัสดีพี่โอ๋ค่ะ...เพิ่งเข้ามาอ่านเวปของพี่โอ๋เป็นครั้งแรกรู้สึกประทับใจมากและที่สำคัญคือได้ความรู้ทาง molec มาแยะเลยค่ะ...จะเป็นกำลังใจให้นะค่ะ

ขอบคุณ คุณสุภาวดี-PSU สำหรับกำลังใจค่ะ อยู่หาดใหญ่ตรงไหนเอ่ย? ถ้าได้ใช้ประโยชน์จากสิ่งที่พี่โอ๋เล่าๆไว้ด้วย ก็ยิ่งทำให้ดีใจนะคะ มีอะไรที่คิดว่าพี่โอ๋จะช่วยก็เขียนมาคุยมาถามได้ค่ะ

แจ่มนภา
IP: xxx.151.232.70
เขียนเมื่อ 

หนูกำลังทำสัมมนาเรื่อง TaqMan real-time PCR assay for specific detection of Opisthorchis viverrini DNA in Thai patients with hepatocellular Carcinoma and cholangiocarcinoma อยากถามว่า

1.TaqMan probe มีข้อดี-ข้อด้อยกว่า probe ชนิดอื่นอย่างไร

2. ผลที่ได้จากการทำ real-time PCR assay จะหน้าเชื่อถือได้หรือไม่ถ้าไม่ใช้ reference gene

3.เค้าใช้ RPLO เป็น reference gene แล้ว RPLO มีคุณสมบัติอย่างไรค่ะ

แก้ข้อสงสัยให้หน่อยค่ะ ด่วนมาก

IP: xxx.25.46.146
เขียนเมื่อ 

Taqman probe เป็น DNA sequence specific

IP: xxx.25.13.32
เขียนเมื่อ 

Taqman probe เป็น DNA sequence specific

Taqman probe ราคาแพง probe เสีย ง่าย สร้างใหม่เสียเวลาสั่งนาน

หน้าเชื่อถือได้หรือไม่ อยู่ที่ method validation

มีไฟล์ pdf ที่อธิบายเกี่ยวกับ Taqman probe รวมทั้งข้อดี ข้อเสียและมีประวัติของ Q-PCR ได้ค่อนข้างละเอียดแต่อ่านง่าย ของคุณ Cristian Orrego, Bill Hudlow, Mark Timken แห่ง Jan Bashinski DNA Laboratory, Department of Justice, State of California อยู่ที่นี่ค่ะ

ขอบคุณคุณ ไม่แสดงตน ที่อุตส่าห์แวะมาช่วยตอบให้ตั้ง 2 รอบนะคะ

สำหรับคำถามของคุณ แจ่มนภา ที่พี่โอ๋ไม่ได้ตอบทันที เพราะไม่ใช่เรื่องที่เชี่ยวชาญโดยตรง และต้องบอกว่าเป็นโรคไม่ชอบคำว่า "ขอด่วนมาก" เลยค่ะ เห็นปั๊บรู้สึกปุ๊บว่า เราทำไม่ได้แน่นอน แล้วพออ่านรายละเอียดคำถามด้วยแล้ว ยิ่งรู้สึกว่าเวลามีสัมมนานี่คุณ แจ่มนภา น่าจะต้องรู้วิธีค้นคว้าด้วยตัวเองก่อนเป็นอันดับแรกค่ะ เริ่มจาก Paper ที่มีในมือนั่นแหละค่ะ ตามดู references ต่างๆที่มีในนั้น จะได้ความรู้พื้นฐานในเรื่องที่มีแน่นอนค่ะ 

อยากรู้
IP: xxx.26.76.141
เขียนเมื่อ 

1.PCR เป็นการบอกว่าตัวอย่างนั้นเคยมีสิ่งที่เราต้องการตรวจ?

2.ถ้าตัวอย่างผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว ตรวจด้วยวิธี RT-PCR พบ แต่ตรวจด้วยการเพาะเชื้อตามปกติ ไม่พบ จะสรุปว่างัย

ก็สรุปตามที่พบสิคะ ไม่ยากเลย บอกได้ว่าสิ่งที่เราตรวจนั้นมีเชื้อที่เราตรวจพบด้วยวิธี PCR (ความไวและจำเพาะตามที่วิธีระบุไว้) การที่เพาะเชื้อไม่ได้อาจจะมีสาเหตุมาจากเชื้อถูกฆ่าไปแล้ว หรือเชื้อที่สามารถจะทำให้โตจนตรวจพบได้นั้นมีจำนวนน้อยมากอยู่แล้ว เพราะการเพาะเชื้อให้ขึ้นนั้นก็ต้องประกอบด้วยปัจจัยหลายๆอย่าง ไม่ได้แปลว่าการเพาะเชื้อไม่ขึ้นแปลว่าไม่มีเชื้อ

การสรุปกับการตีความนั้นแตกต่างกันค่ะ การสรุปไม่ยากเลย ทำไปตามที่เราพิสูจน์ได้เท่านั้นเองค่ะ

อยากรู้
IP: xxx.149.25.241
เขียนเมื่อ 

ขอบคุณก็าบ

สิ
IP: xxx.146.139.70
เขียนเมื่อ 

มีข้อสงสัยน่ะค่ะว่า ถ้าต้องการใช้ real time PCR โดยใช้ taqman probe น่ะค่ะ แต่พอดียังไม่เก่งเรื่อง design probe แต่ก็ไม่อยากเสียเงินสั่งซื้อสำเร็จรูปหรือจ้างเค้า design น่ะค่ะ จะหาดู sequence ที่คนอื่นเค้า design ไว้แล้วที่เค้าตีพิมพ์แล้วน่ะค่ะ จะได้มั่นใจว่า probe ที่เค้า design ไว้ใช้ได้จริง ๆ ไว้เป็นข้อมูลด้วยน่ะค่ะ จะหาดูจากของคนอื่นได้บ้างหรือเปล่าคะ หรือว่าส่วนใหญ่เค้าเก็บเป็นความลับกันคะ ขอบคุณค่ะ

น้องสิ [IP: 203.146.139.70]  คะ มี Database ที่เขารวบรวม sequence primer, probe ต่างๆเอาไว้ที่ RTPrimerDB ค่ะ ตอนนี้มี 8000 กว่าแล้ว ลองเช็คดูได้ค่ะ ใส่ชื่อยีนที่เราจะศึกษาหาดูได้

มีเว็บที่ให้เทคนิคการ design Taqman primer and probe มาฝากด้วยค่ะที่ Protocol Online

 

นัท
IP: xxx.131.211.137
เขียนเมื่อ 

อยากทราบกระบวนการของการตรวจ HBV DNA โดยวิธี Real Time PCR Taqman prob คือหนูทำวิจัยเรื่องนี้ค่ะแต่ค้นข้อมูลแล้วอ่านไม่ค่อยเข้าใจช่วยอธิบายหน่อยนะค่ะ

คุณนัทคะ พี่โอ๋รู้สึกว่าการตรวจ HBV ด้วย Real Time PCR Taqman probe เท่าที่อ่านๆดู เป็นงานที่ค่อนข้างตรงไปตรงมามากเลยนะคะ ยกตัวอย่างจาก paper ที่เอามาแปะข้างล่างนี้ ลองอ่านตรงที่ขีดเส้นใต้ดูนะคะ พี่โอ๋ใส่คำอธิบายเพิ่มเติมให้นิดหน่อย

World J Gastroenterol (2005) 11: 508-10.

Detection of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using TaqMan-MGB probe technology.

JR Zhao, YJ Bai, QH Zhang, Y Wan, D Li, XJ Yan

AIM: To develop a real-time PCR for detecting hepatitis B virus (HBV) DNA based on TaqMan technology using a new MGB probe. METHODS: Plasmid containing the sequence of X gene (1414-1744 nt) was constructed as HBV-DNA standard for quantitative analysis. (เขาใช้ standard จาก plasmid ซึ่งก็เป็นวิธีปกติทั่วๆไปน่ะค่ะ เพื่อให้ได้ยีนที่ต้องการแล้วเราสามารถวัดปริมาณได้ แล้วก็เอามาทำเป็น standard ด้วยการทำ dilution ต่างๆให้ครอบคลุมปริมาณเชื้อใน sample ที่เราจะตรวจหา) A TaqMan-MGB probe between primers for amplification was designed to detect PCR products. (ออกแบบ probe ที่เอาไว้ detect PCR products ที่ต้องการ ก็คือ HBV) The interested sequence contained in the plasmid and in clinical specimens was quantitatively measured. (แล้วก็เอา sample มา run เทียบกับ standard ที่ได้จาก plasmid ก็จะวัดปริมาณใน sample ได้) RESULTS: The detection limit of the assay for HBV DNA was 1 genome equivalent per reaction. A linear standard curve was obtained between 10(0) and 10(9) DNA copies/reaction (r>0.990). None of the negative control samples showed false-positive reactions in duplicate. HBV DNA was detected in 100% (50/50) of HBV patients with HbeAg, and in 72.0% (36/50) with HBsAg, HBeAb and HBcAb. The coefficient of variation for both intra- and inter-experimental variability demonstrated high reproducibility and accuracy. CONCLUSION: Real-time PCR based on TaqMan-MGB probe technology is an excellent method for detection of HBV DNA.

run
IP: xxx.28.179.13
เขียนเมื่อ 

สวัสดีค่ะพี่โอ๋

รันทำ multiplex realtime PCR ค่ะตอนนี้มีปัญหาเรื่องการปนเปือน แก้ยังงัยก็ไม่หายค่ะ เช่นเปลี่ยนตู้ใส่ DNA ต่างหาก pipette แยกต่างหาก ทุกอย่าง clean หมดเลย แต่ negative มันก็ขึ้นตลอด หนูควรจะทำยังงัยดีคะ เหนื่อยใจมากค่ะ

เข้าใจความรู้สึกของน้องรันมากเลยค่ะ เคยเจอรุ่นน้องพบปัญหานี้มาหลายคนมากเลย พี่โอ๋เองก็เคยเจอสมัยที่เริ่มทำแรกๆ การที่จะแก้ปัญหานี้ได้ต้องเปลี่ยนกันทุกอย่างเลยค่ะ ที่เคยเจอส่วนมากจะเป็นจาก reagents มากกว่าพวกเครื่องมือค่ะ พวก buffer, Mg, DW นี่แหละตัวดีเลย บางทีเราไปแก้ซะไกลที่แท้ก็จากตัวที่เรานึกไม่ถึงนี่แหละค่ะ เจอมาหลายรายแล้ว ขอให้แก้ไขได้ในไม่ช้านะคะ 

นัท
IP: xxx.131.209.242
เขียนเมื่อ 

ขอบคุณพี่โอ๋มากค่ะ

ตอนนี้ทำ Real time PCR ของHBV อยู่ negative ปนเปื้อนตลอดเลยค่ะ ก็ลองเปลี่ยน ทุกอย่างใหม่หมดเลย แต่ก็ยังไม่หาย อาจารย์เลยเปลี่ยนตัว Master mix ใหม่ แต่ตอนนี้รอของอยู่ อยากทราบว่ามีวิธีที่สามารถ ทดสอบ Taqman probe กับ Master mix ว่าปนเปื้อนได้หรือเปล่าค่ะ

mim
IP: xxx.121.11.204
เขียนเมื่อ 

- การเกิด polymorphism ในบริเวณที่เป็น intron อ่ะค่ะ จะมีผลอย่างไรค่ะ? แลัวทำไมเค้าถึงได้สนใจศึกษา polymorphism ในบริเวณที่เป็น intron กันคะ?

- แล้วถ้าหนูอยากได้รูปภาพที่เป็น gene nrf2 ที่แสดงส่วนประกอบทั้ง intron ,exon และ promoter อ่ะคะ พี่โอ๋พอจะแนะนำหนูได้มั้ยคะ?

mim
IP: xxx.121.11.204
เขียนเมื่อ 

ขอถามอีกอย่างนะคะพี่โอ๋ ทำไมเค้าถึงเรียก SNP ของ nrf2 ว่า rs6726396 (คำว่า rs มาจากอะไรหรอคะ) ??

ตอบคำถามคุณ mim ด้วยคำถามหน่อยนะคะ เพราะคำถามนี้ถ้าเรียนพื้นฐานเกี่ยวกับยีนมาแล้วน่าจะรู้โดยไม่ต้องถามน่ะค่ะ คุณ mim คิดว่า intron อยู่ที่ไหนบ้างใน sequence ของยีน และก่อนจะไปถึงขั้นตอนที่ไม่มี intron นั้นยีนมีการเปลี่ยนแปลงยังไง ตอบคำถามพื้นฐานนี้ได้ก็น่าจะคิดออกว่า การเปลี่ยนแปลงใน intron จะมีผลอย่างไร และทำไมเขาถึงศึกษา SNP ใน intron กันนะคะ สำหรับคำถามที่สองค่อยน่าตอบหน่อยค่ะ เวลาที่เราต้องการหาความรู้เกี่ยวกับยีนอะไรสักอย่างนี่ พี่โอ๋จะไปเริ่มที่เว็บไซต์ Entrez ของ NCBI ที่ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gquery?itool=toolbar เป็นแหล่งรวมข้อมูลเกี่ยวกับยีนต่างๆ ใส่ชื่อยีนนี้เข้าไปแล้วคลิก Go ก็จะได้ข้อมูลสารพัดหัวข้อเกี่ยวกับยีนที่เราต้องการ เลือกเอาได้ตามต้องการเลย และจะมีลิงค์ไปมาถึงกันในหัวข้อต่างๆ รวมทั้งมีรายชื่อ references ที่เกี่ยวกับยีนนั้นๆตั้งแต่เริ่มค้นพบมาเลยค่ะ

สำหรับ rs ย่อมาจาก "Reference SNP ID" ถ้าอยากหาความรู้เกี่ยวกับ SNP ให้ไปดูที่เว็บนี้ได้เลยค่ะ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=snp เป็นที่เริ่มต้นที่ดีในการหาความรู้เกี่ยวกับการค้นคว้าทาง SNP ค่ะ