Basic Real-time PCR (4): Real-time PCR คืออะไร
เอกสารที่เขียนไว้เพื่อการอบรมเชิงปฏิบัติการ Realtime PCR and its applications ในหัวข้อต่อไปเป็นการมารู้จักกับ PCR แบบ Real-time กันดูว่า จะทำความเข้าใจได้ง่ายๆยังไงกันดี
แปลตรงตัวได้ความหมายที่สุดคือ PCR ในขณะที่กำลังเกิดขึ้นจริงๆ ทำให้สามารถติดตาม PCR ในช่วง exponential phase ได้อย่างแม่นยำ ซึ่งนำไปสู่การวัดปริมาณได้ โดยมีสมการของ PCR ดังนี้
Xn = X0(1 + E)n
โดย Xn คือ ปริมาณ PCR product ที่ cycle ที่ n
X0 คือ ปริมาณเริ่มต้นของ template
E คือ Amplification efficiency
n คือ cycle number
สมการเหล่านี้ เราไม่ต้องจดจำเลย เพราะเครื่อง Real-time PCR ทุกชนิดมี software ที่รองรับการคำนวณปริมาณให้เราอยู่แล้ว เพียงแต่เราต้องเข้าใจธรรมชาติของปฏิกิริยา และวิธีการในการติดตามเก็บค่าต่างๆระหว่างที่ปฏิกิริยาดำเนินอยู่ รวมทั้งการแก้ไขปรับปรุงสภาวะเพื่อให้ปฏิกิริยามีประสิทธิภาพสูงสุดเท่าที่จะทำได้ จึงจะทำให้ผลที่ได้ถูกต้องแม่นยำ
ไม่ยากเลยใช่ไหมคะ ถ้าหากเราไม่คิดให้มันยุ่งยาก กระบี่อยู่ที่ใจ (เข้ากันไหมเนี่ย) ตอนหน้าจะเป็นการเปรียบเทียบให้เห็นว่า PCR ธรรมดากับแบบ real-time นี่ ต่างกันตรงไหนบ้างค่ะ
หัวข้อนี้ต่อมาจาก
- (1) PCR คืออะไร
- (2) ขั้นตอนพื้นฐานของ PCR
- (3) ธรรมชาติของปฏิกิริยา PCR
ดาวน์โหลดเอกสารทั้งฉบับได้ตรงนี้เลยค่ะ Basic RealTime PCR
ความเห็น (39)
สวัสดีค่ะคุณโอ๋
แวะมาอ่านเรื่อง real time PCR ค่ะ วิธีนี้ใช้ validate ผลการทดลองจาก microarray ด้วยนะคะ ตอนแรกณิชก็คิดว่าจะทำ แต่ตอนนี้เปลี่ยนใจมาเช็คผลจาก PCR ธรรมดาที่หลาย ๆ cycle แทนค่ะ .. แต่อาจต้องทำ real time ยืนยันผลอีกครั้งตอนจบ อิอิ
ขอบคุณสำหรับเนื้อหา real time PCR นะคะ :D
ณิช
สวัสดีค่ะคุณโอ๋
กำลังจะทำ real time อยู่พอดีเลยค่ะ คุณโอ๋พอจะมีโปรโตคอล มั้ยคะ.. ตอนนี้มีโปรโตคอลให้เลือกใช้เต็มไปหมดเลย จนเริ่มงงว่าจะใช้แบบไหนดี กำลังจะใช้ไซเบอร์กรีนค่ะ..
ดีใจที่ได้เห็นบล็อกแลกเปลี่ยนความรู้ด้านโมเลกุล่าของคนไทยค่ะ
ดีใจที่มีคนได้ประโยชน์ค่ะ คุณณิช พี่อยู่ที่โน่นเป็น consultant ให้นักศึกษาเยอะแยะ อยากมีโอกาสทำให้คนไทยบ้างอยู่แล้วค่ะ
คุณนุ่นคะ พี่มี worksheet ที่ทำไว้ใช้เป็น basic protocol แบบนี้ค่ะ
Master mix: (Magnesium concentration = 1.5 mM)| Reagents | Volume for one tube (microlitre) | Volume for tube (microlitre) |
| Sterile H2O | 6.2 | |
| 10x RB | 2.0 | |
| dNTPs | 1.0 | |
| MgCl2 (50mM) | 0.6 | |
| BSA | 1.0 | |
| 10mM F-primer | 1.0 | |
| 10mM R-primer | 1.0 | |
| SYBR Green I | 2.0 | |
| Platinum Taq (5U/microlitre) | 0.2 |
Add 15microlitre into each tube + 5microlitre of template
ถ้าใช้ความเข้มข้นของ Magnesium ต่างออกไปก็ไปปรับตรงน้ำกลั่น แล้วช่องข้างๆก็เอาไว้คำนวณเวลาทำ mastermix สำหรับ set ใหญ่ๆทีเดียวเลย (ปกติพี่จะ run 72 tubes อะไรแบบนั้นน่ะค่ะ)
สำหรับรายละเอียดของ reagent ต่างๆก็คือ
DNA Polymerase: 1U/20ml reaction (amplitaq or Platinum Taq)
dNTPs: diluted 1/2.5 of 40 mM(provided in 50ml in each aliquot)
Add 1ml /20ml reaction
10x Reaction Buffer: 2ml/20ml reaction (provided 1 ml in each aliquot)
(12.5 ml of 1M KCl + 2.5 ml of 1M Tris-HCl pH 8.3 + 0.125 ml of 20mg/ml Gelatin + sterile water make up to 25 ml)
BSA: Add 1ml of a 25mg/ml solution/20ml reaction
SYBR Green: 2ml of 5x solution/20ml reaction
(provided in 10ml of 100x in each aliquot, made up 5x by adding 190ml of 1xTBE)
25mM MgCl2: As required
Template: 2ml /20ml reaction
Primers: 10 pmol/ml
2ml of each primer/20ml reaction
น้องนุ่นคะ เป็นกำลังใจให้นะคะ อะไรที่ยากๆนี่พอผ่านไปได้แล้วจะยิ่งทำให้เราภูมิใจกับผลยิ่งกว่าเรื่องง่ายๆนะคะ ยังไม่เคยได้ยินใครบอกว่า analyse microarray สนุกเลยค่ะ ไม่ต้องกลัว (แสดงว่าเราปกติดี) สมัยนี้น่าจะมี software ดีๆมาช่วยมากขึ้นแล้วนะคะ มองหาให้ดีๆ
พี่โอ๋เคยเจอมาแล้ว สมัยที่ analyse ผล real-time PCR ตอนที่เทคโนโลยีนี้เพิ่งเกิดใหม่ๆ เราทำกันตาหูลาย (จนอยากกระโดดตึกเหมือนกัน) กว่าจะได้ผลออกมาอย่างที่เราพอใจ พอปีถัดมาก็มีคนพัฒนาโปรแกรมออกมา ใส่ข้อมูลเข้าไปกดไม่กี่ทีได้ผลออกมาแบบที่เรานั่งทำแทบตายนั่นแหละ ยินดีช่วยในส่วนที่พอจะทำได้นะคะ
ช่วยบอกหลักการทำงานของเครื่องCOBAS AmpliPreb COBAS/Taqman system ได้ไหมค่ะ ทำสัมนาเรื่องนี้อยู่ ขอบคุณคะ
ขอบคุณพี่มากๆครับ สำหรับความรู้ดีๆที่มีให้ครับ หากมีการอบรมเมื่อไรเรื่องเรียลไทม์พีซีอาร์รบกวนช่วยส่งข่าวผ่านเมลให้ด้วยนะครับ
ขอบคุณครับ
เพิ่งได้กลับมาอ่านความเห็นในบันทึกนี้อีกที ป่านนี้คุณนุ่นคงจะเป็นผู้เชี่ยวชาญไปแล้ว เริ่มด้วยตั้ง 6 genes นี่ วิเคราะห์กันจนเก่งแน่ค่ะ
ส่วนคุณมีนา ก็คงสัมมนาเสร็จไปแล้วเรียบร้อย สิ่งที่ถามมานั้น ถามพี่ Google มีข้อมูลเพียบเลยค่ะ เพราะเจ้าของระบบเขาโฆษณาจะแย่ หาข้อมูลได้ง่ายๆมากเลยค่ะ แต่ต้องใส่ชื่อให้ถูกเท่านั้นเอง ต้องเป็น COBAS Ampliprep COBAS/Taqman system น่ะค่ะ ไม่ใช่ Amplipreb
ที่ภาควิชาเราจัดอบรมกันไปนานมากแล้วค่ะ และคงไม่ได้จัดใหม่ แต่เอกสารประกอบที่พี่โอ๋จัดทำไว้ คุณ noppadol จะโหลดเอาไปอ่านดูก็น่าจะเข้าใจได้ไม่ยากค่ะ พี่โอ๋พยายามเขียนให้อ่านแล้วเข้าใจได้ง่ายๆ ที่บันทึกนี้นะคะ มีอะไรสงสัยต้องการให้อธิบายเพิ่มเติมก็ถามผ่านมาทางบล็อกได้เลยค่ะ ยินดีแลกเปลี่ยนแบ่งปันสิ่งที่เรียนรู้มาอย่างเต็มที่เลยค่ะ
สวัสดีค่ะน้องโอ๋
พี่มีเรื่องอยากจะปรึกษาน้องหน่อยค่ะ คือว่าพี่เพิ่งจะเริ่มทำ RT-PCR พี่อยากจะขอคำแนะนำจากน้องหน่อยนะคะ คือว่าพี่ใช้ kit ของ invitrogen พี่อยากจะดู copy number ของ DNA ของเชื้อไวรัสในกุ้ง ส่วนตัวเครื่องเป็นของ Bio-rad พี่จะต้องเริ่มทำยังไงก่อนดีค่ะ อยากจะให้น้องช่วยแนะนำหน่อย เพราะว่าไม่ค่อยเข้าใจในการทำ real-time สักเท่าไหร่ อีกอย่างหนึ่งนะคะ คำว่า qRT-PCR กะ RT-PCR เหมือนกันหรือเปล่าค่ะ ขอความกรุณาช่วยบอกพี่ด้วยนะคะ ขอบคุณมากคะ
พี่ติ๊ก
ตอบพี่ติ๊กเรื่อง qRT-PCR กับ RT-PCR ก่อนนะคะ ตัว q นี่เขาเพิ่มมาเพื่อจะหมายถึง quantitative คือการวัดปริมาณน่ะค่ะ ก็จะจำเพาะกว่าแค่ RT-PCR ซึ่งหมายรวมถึง Real-time PCR ที่รวมทั้งแบบ identification เฉยๆ กับทั้งการวัดปริมาณด้วย
จริงๆเทอมต่างๆที่ใช้ในเทคโนโลยีนี้นั้น ก็ต่างคนต่างคิดกันขึ้นมา ถ้าเรารู้หลักการเราก็จะพอเดาได้ค่ะ คงจะยังมีอีกหลายคำตามๆกันมา โดยเฉพาะเมื่อมีการ design probes และ primers สำหรับหลายๆวิธีการ สนุกๆทั้งนั้นค่ะ คนเขาช่างคิดกันจริงๆ
สำหรับ เชื่อไวรัสที่พี่ต้องการวัดปริมาณในกุ้งนั้น ถ้าเขามี kit ขายก็ต้องมีใบแนบ ขอแนะนำให้พี่เริ่มจากดู reference ที่อยู่ในใบแนบ kit นั้นแหละค่ะ เขาก็จะรายงานขั้นตอนต่างๆเอาไว้ อ่านตรงไหนไม่เข้าใจ หรือยังคงเริ่มไม่ถูก ถามมาใหม่ได้เลยค่ะ ขอชื่อเรื่องและคนเขียนมาด้วยนะคะ จะได้ช่วยกันแนะนำได้ถูกค่ะ
ขอบคุณมากนะคะ ตอนนี้พี่กำลังต้องพูดสัมมนาเกี่ยวกับพวก TaqMan อยู่ค่ะ มึนตึ๊บ ๆ เลยค่ะ แต่จะค่อย ๆ พยายามทำความเข้าใจให้มากที่สุดค่ะ
ขอบคุณมากนะคะ
เฮ้อ.. เสร็จไปแล้วค่ะ กลับมาอยู่เมืองไทยแล้วด้วยค่ะ ตอนนี้ลืมหมดแล้วค่ะ ฮ่าฮ่า.. แต่มีโปรเจคใหม่.. กำลังจะพยายามทำบล็อกเผยแพร่ความรู้แบบคุณโอ๋นะคะ อะไรที่เคยรู้แล้วไม่ได้ใช้นาน ๆ นี่ก็ลืมไปได้อย่างรวดเร็วเลย หวังว่าซักวันนึงจะมีบล็อกเอาไว้แลกเปลี่ยนความรู้กับคนอื่นบ้างค่ะ เพื่อกระตุ้นเซลล์สมองของตัวเองด้วยแหล่ะค่ะ
ดีใจด้วยมากๆเลยนะคะ คุณนุ่น ที่กลับมาบ้านเราแล้ว สำเร็จเรียบร้อยดีใช่ไหมคะ และดีใจมากๆที่คุณนุ่นจะเขียนบล็อก ประสบการณ์นี่แหละค่ะของมีค่าน่าแลกเปลี่ยน เขียนแล้วจะรู้ค่ะว่า ประโยชน์ที่เรานึกไม่ถึงนั้นมีเยอะทีเดียว ทั้งต่อตัวเราเองและผู้อื่นด้วยค่ะ สมัครสมาชิกที่ GotoKnow นี่เลยก็ได้นะคะ อย่าลืมมาแวะบอกกันอีกนะคะ ขอบคุณมากค่ะ มีอะไรอยากให้ช่วยก็ติดต่อพี่โอ๋ได้ที่ อีเมลติดต่อ จะได้เขียนคุยได้ยาวๆค่ะ
ชีวิตนุ่นเปลี่ยนไปแล้วค่ะ สงสัยจะไม่ได้ทำการทดลองแล้วมั้งคะ ตอนนี้ทำอยู่บริษัทซะแล้ว ยิ่งนานเข้าก็ยิ่งลืม.. พยายามตามอ่าน อัพเดตเรื่องราวของคุณโอ๋แล้วทำความเข้าใจตามไปเรื่อยๆ ดีกว่า เผื่อมีโอกาสได้กลับไปทำแลบอีกครั้งจะได้ไม่ต้องรื้อฟื้นกันมาก.. ขอบคุณนะคะ
ยังไงก็ดีใจอยู่ดีค่ะที่คุณนุ่นยังคงติดตามมาบอกกัน ไม่ได้ทำแล็บแล้วก็ยังเขียนเล่าเรื่องราวประสบการณ์ในชีวิตได้นะคะ พี่โอ๋เองก็ไม่ได้ทำแล็บพวกนี้เลย ได้แต่ช่วยแนะนำบ้างเท่านั้น วิทยาการด้านนี้วิ่งเร็วมากค่ะ แต่ยังไงๆพื้นฐานที่เราเคยทำๆมาก็ยังมีค่าเสมอแหละค่ะ
คุณนุ่นเขียนเล่าเรื่องอะไรเมื่อไหร่ อย่าลืมแวะมาบอกกันนะคะ
คืออาจารย์ให้หนูทำรายงานเรื่อง real time อาจารย์ให้หาการนับจำนวนรอบของ real time ในแต่ละ copy ว่าทำไมจึงได้จำนวน copy ออกมาเท่านั้น ให้อธิบายขั้นตอนให้หนูดูหน่อยนะค่ะ ขอบพระคุณล่วงหน้าเป็นอย่างสูง ( ด่วนมากนะค่ะ จะส่งแล้ว ยังหาไม่ได้เลยค่ะ )
สวัสดีค่ะ พี่โอ๋ ขอเรียนสอบถามหน่อยนะค่ะ
คือว่าหนูต้องทำสัมมนาเรื่อง Immune-related gene expression นะึค่ะ แล้วเห็นในเปเปอร์ว่า ผลของการทำ rial-time PCR ให้หน่วยออกมาเป็น Flod change นะค่ะ หนูไม่ค่อยเข้าใจว่าผลทางบวก กับ ลบ เราจะแปลลความหมายออกมาว่าอย่างไรถึงจะถูกค่ะ
ขอบคุณค่ะ
คำถามของคุณ นวลจันทร์ [IP: 203.107.154.223] นี่เป็นพื้นฐานมากๆของ PCR ธรรมดานี่แหละค่ะ ลองกลับไปหาอ่านดูนะคะ อยากให้ทำความเข้าใจให้ได้ อย่าทำเพื่อส่งอาจารย์อย่างเดียว เรื่องพื้นฐานนี่เมื่อเข้าใจแล้ว เรียนอะไรต่อไปก็จะไม่ยากค่ะ
คำถามด่วนมากนี่ ขออนุญาตฝากไว้ตรงนี้ว่า ตอบด่วนไม่เป็นนะคะ
คำถามของคุณ Aom [IP: 140.120.98.176] อธิบายสั้นๆยากหน่อยนะคะ เอาเป็นว่า การเปลี่ยนแปลงที่เป็น fold change (ไม่ใช่ flod นะคะ) นั้น คือการเปรียบเทียบกันน่ะค่ะ ว่ามีการเปลี่ยนแปลงไปกี่เท่า (คือ fold change นี่แหละค่ะ) ทั้งทางมากกว่า น้อยกว่า ก็คือ บวกหรือลบ นั่นเอง จะแปลผลยังไงก็คงต้องเอาตัวอย่างมาดูถึงจะอธิบายให้เข้าใจได้ง่ายขึ้นน่ะค่ะ
สงสัยเรื่อง real-time PCR ค่ะ พอดีไปอ่านเปเปอร์มา เป็นประโยคด้านล่างค่ะ อยากทราบว่าในเปเปอร์นี้เค้าใช้วิธีอะไรค่ะ เพราะไม่เห็นเค้าบอก probe มาให้ ก็เลยงงๆ นิดหน่อย แล้วขั้นตอนเป็นยังไง เพราะยังไม่เคยทำค่ะ
ถ้ายังไงรบกวนอธิบายให้หน่อยนะคะ ขอบคุณมากเลยค่ะ
Real-time quantitative PCR (q-PCR) was performed on the LightCycler version 1.1 instrument with Roche Applied
Science (Indianapolis, IN) reagents, according to the manufacturer’s recommendations. cDNA template concentrations were determined using Ribogreen (Invitrogen) and equivalent concentrations were used for each
q-PCR. Fluorescence was captured at the end of each extension cycle, over a total of 45 cycles. Crossing points were determined by a second derivative algorithm intrinsic to the Lightcycler software and normalized to a constitutively
expressed gene (b2-microglobulin). Primer sequences are available upon request.
ตอบคุณ ออม [IP: 125.24.98.241] ว่า ในเปเปอร์นี้เขาใช้เครื่อง LightCycler และใช้ kit น้ำยาสำเร็จรูปของบริษัทเลยซึ่งน่าจะเป็นแนวทางมาตรฐานในปัจจุบันค่ะ เวลาเขียนเปเปอร์ก็เลยกระชับแบบที่เห็น วิธีนี้มีพื้นฐานมาจากการติดตามดู fluorescense signal ซึ่งเกิดขึ้นในปฏิกิริยา ตามที่บอกมาในเปเปอร์นี้เฉพาะส่วนนี้ไม่ได้ชี้ชัดว่าเขาใช้ non-specific system พวก SyberGreen หรือใช้ specific hybridization probe เขาอาจจะรายงานในส่วนอื่นๆของเปเปอร์น่ะค่ะ ลองอ่านในส่วนของ result ดูนะคะ
ขอแนะนำให้ลองอ่านกลไกพื้นฐานจากเอกสารเรื่องนี้ที่มีไว้ให้ดาวน์โหลดนะคะ เขียนไว้เป็นภาษาไทยและคิดว่าน่าจะเข้าใจง่ายสำหรับทุกคนค่ะ
รบกวนขอprotocol การทำ Quantitative Reverse Transcription PCR ได้ไหมครับ ขอบคุณครับ
คุณบาสลองเข้าไปดูที่ http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/PCR/Real-Time_PCR/index.html นะคะมีสารพัด protocol ให้เลือกเลยค่ะ รวมทั้งที่ถามมาด้วยค่ะ
คือผมกำลัง งง ว่า Quantitative Reverse Transcription PCR ต่างจาก Real-time PCR น่ะครับ (จากที่อาจารย์บอกมา)
ผมก็เลยค้นจากprotocol ที่คุณโอ๋แนะนำมาให้ แล้วก็เจอ protocol ตัวนี้ตัวเดียวที่ใช้ได้
http://www.utexas.edu/research/sissonlab/protocols/molecularbiology/q-RT-PCR.pdf
แต่ไม่ทราบว่าเกี่ยวกันไหม ช่วยแนะนำด้วยครับ
ps. ผมต้องการวัดระดับ Steady state mRNA ของยีน OsCML โดยวิธี "Quantitative RT-PCR" ครับ
ขอรบกวนหน่อยน่ะค่ะหนูกำลังแปลเปเปอร์เกี่ยวกับการทำreal-time PCR อยู่ค่ะหนูส่งสัยว่าssrA gene มันคืออะไรอะค่ะแล้วAICมันคืออะไรอ่ะค่ะ หนูงงมากเลย ยังไงก็ช่วยหนูที่น่ะค่ะ ขอบคุณค่ะ
2.4. L. monocytogenes real-time PCR assay
Real-time PCR amplification was performed on the LightCycler
using the ‘‘LightCycler FastStart DNA master hybridization probes’’
kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). PCR was performed
in a final volume of 20 ml including 2 ml of template DNA in 10
LightCycler hybridization buffer with MgCl2 adjusted to 5 mM
concentration. PCR primers (0.5 mM concentration) and FRET
hybridization probes for L. monocytogenes and IAC targets (0.2 mM
concentration) were added to the reaction mixture and the volume
was increased to 20 ml by addition of nuclease free dH2O. The
cycling parameters consisted of: 95 C incubation for 10 min for
enzyme activation and DNA denaturation, followed by 45 PCR
amplification cycles consisting of 95 C for 10 s, 55 C for 20 s and
72 C for 10 s. The temperature transition rate for all cycling steps
was 20 C/s. Fluorescence acquisition was at the end of the
annealing stage of each cycle. The thermocycling program was
followed by a melting program of 95 C for 1 min (denaturation),
45 C for 30 s (annealing), and then 45–80 C at a transition rate of
0.1 C/s with continual monitoring of fluorescence. All subsequent
analysis was carried out in the F2/BackF1 (ssrA gene target) and F3/
BackF1 (IAC) channels with colour compensation using the second
derivative maximum option of the LightCycler software (version
3.5). A no-template negative control was included in each run.
2.5. Sequencing of real-time ssrA gene PCR products
For food samples negative for L. monocytogenes by the standard
method which yielded a positive result with the rapid method, the
ssrA gene PCR product generated in the rapid method for these
samples was sequenced (Sequiserve, Vaterstetten, Germany).
ขอบคุณมาก ๆ ค่ะ เขียนได้เข้าใจดีจัง รออ่านตอนต่อไปนะคะ
ตอบหนูกุ้งนะคะ
All subsequent analysis was carried out in the F2/BackF1 (ssrA gene target) and F3/
BackF1 (IAC) channels with colour compensation using the second
derivative maximum option of the LightCycler software (version
3.5).
ตรงที่หนูสงสัยนั้นเป็น setting ของ channels ในเครื่อง lightCycler สำหรับ analyse fluorescence signals ที่เราวัดได้น่ะค่ะ ขึ้นกับว่าเขาให้ dye ตัวไหนตรงไหน (ถ้าไม่เคยใช้เครื่อง LightCycler อาจจะไม่เข้าใจก็ได้ค่ะ)
ขอบคุณมากค่าๆๆๆๆๆ หนูจะได้ไปอธิบายให้อาจารย์ฟังถูก
ขอสอบถามค่ะ พอดีตอนนี้กำลังศึกษาเรื่อง binding DNA แล้วตรวจวัดปริมาณ (copies DNA )โดยใช้ qRT-PCR SYBR GREEN
ซึ่งตอนนี้มีปัญหาคือว่า ต้องทำ STANDARD CURVE แต่ปรากฏว่า R2 < 0.99 ตลอด ไม่แน่ใจว่าปัญหาเกิดจากอะไร
ตัว STANDARD CURVE จะใช้ binding DNA นำมา Dilution ตั้งแต่ 10^8 - 10^2 copies ค่ะ.. ตอนแรกคาดว่าเป็นเพราะ
ใช้ปิเปตไม่ได้มาตรฐาน ก็เลยให้รุ่นน้องมาทำให้ ปรากฏว่าผลที่ได้เหมือนกันเลย..
เลยคิดว่าปัญหาอาจเกิดจาก การตั้งค่าของเครื่องหรือเปล่าค่ะ ใช้เครื่องของ Rotor Gene 3000
แล้วพอดีไปอ่านเจอเรื่อง MasterMixes เห็นมีบางคนใช้ตัวนี้ ไม่แน่ใจว่าจะเกี่ยวกับการทำ STANDARD CURVE หรือเปล่า
หรือถ้าใช้แล้วจะทำให้กราฟมีค่า R2 ดีขึ้นหรือเปล่าค่ะ..
ขอคำแนะนำแล้วก็ขอบคุณค่ะ..
คำถามของคุณ ต่ายจัง [IP: 222.69.242.154] จะขอดู standard curve ทั้ง 4 conc. หน่อยได้ไหมคะ ใช้วิธีตัดแปะหน้าจอมาก็ได้ค่ะ อาจจะบอกปัญหาที่น่าจะเป็นได้
ขอบคุณคุณโอ๋มากๆเลยค่ะ..ที่เสียสละเวลามาตอบ..ขอเล่าเรื่องที่มาก่อนเลยนะคะ..
ตอนแรกได้ทำการเพิ่มปริมาณ DNA โดยใช้ RT -PCR ก่อนค่ะ ในการนี้ต่ายได้ใช้ pUC19 as Template
หลังจากนั้นได้วัดค่าการดูดกลืนแสง และคำนวณหาปริมาณ DNA copies
จากนั้นต่ายถึงได้นำตัวอย่างนั้นมา dilution เพื่อทำ standard curve ปัญหามีดังนี้ค่ะ..
1. กราฟที่ได้ไม่แน่ใจว่า กราฟมาตรฐานจะมีกราฟแบบนี้มั้ยค่ะ
<a href="http://uploadpic.org/showpic-66072/11.html"><img src="http://uploadpic.org/thumb-66072.jpg" border="0" alt="uploadpic.org - click to view full image"></a>
2. ได้้ทำการทดลองเปลี่ยนอุณหภูมิของเครื่องแล้ว กราฟที่ได้ยังเป็นเช่นเดิมค่ะ.
<a href="http://uploadpic.org/showpic-66075/33.html"><img src="http://uploadpic.org/thumb-66075.jpg" border="0" alt="uploadpic.org - click to view full image"></a>
3. หรือว่าการ dilution ผิดวิธี
ขอคำแนะนำด้วยนะคะ.. ต่ายได้อัพรูปแล้วค่ะ..
ขอบคุณคุณโอ๋มากๆ เลยค่ะ
ปล. คุณโอ๋ ดูรูปแล้วยังไงฝากลบรูปให้ด้วยนะคะ.. เพราะบางทีต่ายอาจต้องเอาไปไว้ในทีสิสนะคะ..
ขอบคุณค่ะ..
น้อง ต่ายจัง [IP: 222.69.242.154] คะ ลบรูปได้เลยนะคะ พี่โอ๋ดาวน์โหลดมาดูแล้ว รู้สึกว่า ภาพแรกที่เป็น Quantitation Data น่ะค่ะ หนูไม่ได้เปลี่ยนค่า Threshold ทำให้ไม่ได้เห็นภาพที่ควรจะเห็น ต้องเลื่อนลงมาอยู่แถวๆระหว่าง 10 กำลัง 2 กับ กำลัง 2.5 ดูนะคะ หนูคงต้องกลับไปอ่านคู่มือการ set เวลาจะดูข้อมูลของเครื่องก่อนนะคะ จะได้เข้าใจ เพราะเราต้อง set ให้เป็น data ถึงจะเอามาใช้ได้ เวลาเราจะวิเคราะห์ data พวกนี้เราต้องเลือกส่วนของสัญญาณที่อยู่ใน log phase ของการ amplify ภาพที่หนูส่งมา เส้น threshold มันไปอยู่ที่ plateau phase น่ะค่ะ เลยไม่เห็นอะไร
ลองปรับดูนะคะ
ขอบคุณค่ะพี่โอ๋...เดี่ยวต่ายลองไปปรับดูค่ะ..
ขอบคุณมากๆๆๆเลยค่ะ...
ปล. ต่ายลบรูปไม่ได้ค่ะ..ฝากพี่โอ๋ลบใน บล้อกพี่โอ๋ได้เลยค่ะ..
สวัสดีค่ะ พี่โอ๋ หายไปนานเลยค่ะ ขอบคุณสำหรับคำแนะนำนะคะ หลังจากนั้นต่ายได้ไป ปรับค่าตามทที่พี่โอ๋แนะนำค่ะ
ตอนนี้เปเปอร์นั้นได้รับการตีพิมพ์แล้วค่ะ แต่เป้น International Journal ค่ะ ยังไม่ได้ตีพิมพ์ในขั้นของ SCI
ต่ายจะจบระดับปริญญาโทในเดือน มกราคมนี้ค่ะ ขอบคุณสำหรับคำแนะนำ ความรู้มากๆค่ะ
เป็นบล้อกที่มีประโยชน์มากมายเลยค่ะ
ยังไงสวัสดีปีใหม่ ให้พี่โอ๋ มีความสุขตลอดปีและตลอดไปเลยค่ะ ขอบคุณอีกครั้งค่ะ
ขอบคุณที่แวะมาส่งข่าวดีนะคะ ยินดีมากๆด้วยกับน้องต่ายจังสำหรับความสำเร็จอีกก้าวหนึ่งของชีวิต ขอให้น้องต่ายจังได้ใช้ความรู้ที่ร่ำเรียนฝึกฝนมาให้เกิดประโยชน์กับเพื่อนมนุษย์ในรูปแบบต่างๆเท่าที่จะทำได้นะคะ
พี่โอ๋เชื่อว่าน้องต่ายจังก็จะยินดีที่จะได้ถ่ายทอดแลกเปลี่ยนสิ่งที่เรารู้กับคนอื่นๆเพื่อให้เกิดผลที่ดีๆต่อๆไปเหมือนที่น้องต่ายจังได้เปิดโอกาสให้พี่โอ๋ได้ทำ ขอให้น้องต่ายจังมีความสุขตลอดปีและตลอดไปเช่นกันค่ะ
สวัสดีคะอาจารย์ คือหนูทำPCR พอดีว่าตอนทำแล็ปนั้นเข้าใจผิดว่าPCR buffer มี MgCl2 แต่มารู้อีกทีมันไม่มี สรุปองค์ประกอบPCRไม่ครบ ผลที่ออกมาได้ เป็นsmear band หนูไม่ทราบว่าหนูจะอธิบายผลการทดลองยังไงดีนะคะ รบกวนอาจารย์แนะแนวทางได้ไหมคะ
การที่มี smear band ไม่มี band ที่ชัดเจนก็หมายถึงว่าเราไม่มี specific product ที่เราต้องการ เนื่องจากเราใส่ส่วนประกอบที่ต้องมีในปฏิกิริยาไม่ครบถ้วน มันก็ตรงไปตรงมานี่คะ หนูน่าจะอธิบายได้ ไม่เข้าใจคำถามค่ะ เลยไม่รู้ว่าจะแนะแนวทางยังไง ก็ต้องลองทำแบบสมบูรณ์ถูกต้องดูว่าจะได้ product ที่ต้องการหรือเปล่า