บทปฏิบัติการที่ 3
เทคนิคปลอดเชื้อ
(Aseptic Techniques)          
ทุกหนทุกแห่งย่อมมีเชื้อจุลินทรีย์ปะปนอยู่เสมอ ไม่ว่าจะเป็นบนโต๊ะปฏิบัติการ มือของผู้ทดลอง เครื่องมือเครื่องใช้ในการทดลอง อากาศรอบ ๆ ห้องปฏิบัติการ   ดังนั้นนักจุลชีววิทยาจึงมีความจำเป็นต้องทราบเทคนิคการถ่ายเชื้อจุลินทรีย์ด้วยวิธีปลอดเชื้อ  เพื่อให้เชื้อจุลินทรีย์ที่ทดลองไม่ปนเปื้อนด้วยเชื้อจุลินทรีย์ชนิดอื่นที่ไม่ต้องการระหว่างการทำงาน          เทคนิคปลอดเชื้อ (Aseptic Technique) เป็นเทคนิคที่ป้องกันไม่ให้เชื้อจุลินทรีย์ชนิดอื่นที่ไม่ต้องการปนเปื้อนลงไปในเชื้อจุลินทรีย์ที่กำลังทำการทดลองอยู่  นอกจากนั้นยังป้องกันไม่ให้เชื้อ     จุลินทรีย์ที่กำลังทำการทดลองอยู่ออกมายังสิ่งแวดล้อม  ซึ่งอาจเป็นอันตรายต่อผู้ทดลองหรือผู้อื่นได้          ทำอย่างไรจึงจะสามารถป้องกันไม่ให้เชื้อจุลินทรีย์ที่ทดลองมีการปนเปื้อนเชื้อจุลินทรีย์ชนิดอื่นและขณะเดียวกันเชื้อจุลินทรีย์ที่ทดลองไม่แพร่กระจายออกสู่สิ่งแวดล้อม ขอให้ยึดกฎทั่วไปสำหรับเทคนิคปลอดเชื้อดังนี้
1.      ก่อนทำการทดลอง·          สวมเสื้อทดลองให้เรียบร้อย ผมต้องไม่รุงรัง·          เอาของทุกอย่างที่ไม่เกี่ยวข้องกับการทดลองออกไปจากโต๊ะปฏิบัติการ·          ล้างมือให้สะอาด·          เช็ดโต๊ะปฏิบัติการด้วยน้ำยาฆ่าเชื้อจุลินทรีย์
2.      หลังทำการทดลอง·          ฆ่าเชื้อจุลินทรีย์บนเครื่องใช้ทุกครั้งที่ใช้งานแล้ว·          เช็ดโต๊ะปฏิบัติการด้วยน้ำยาฆ่าเชื้อจุลินทรีย์
·          ถอดเสื้อทดลองออก
·          ล้างมือให้สะอาด
3.      ขณะทำการทดลองเมื่อปากหลอดที่มีเชื้อจุลินทรีย์เปิดออก ต้องปฏิบัติดังนี้
·          ต้องทำการทดลองใกล้เปลวไฟเพื่อป้องกันไม่ให้เชื้อจุลินทรีย์ชนิดอื่นปนเปื้อนลงไปและป้องกันไม่ให้เชื้อจุลินทรีย์ที่ทดลองหลุดออกไปอยู่ตามสิ่งแวดล้อม
·          ต้องไม่พูดคุยกัน
·          ต้องไม่วางฝาหลอดทดลองหรือจุกสำลีไว้บนโต๊ะ
·          ทำงานอย่างรวดเร็ว 

วัตถุประสงค์

          เพื่อรู้จักเทคนิคการเทอาหาร การถ่ายเชื้อจุลินทรีย์จากหลอดหนึ่งไปยังอีกหลอดหนึ่งด้วยวิธีปลอดเชื้อ

การทดลองที่ 1    การฝึกเทคนิคเทอาหารเลี้ยงเชื้อลงในจาน (petri dish) ด้วยวิธีปลอดเชื้อ

                          (Aseptically dispensing agar into petri dishes) (คลิกดู slides)          การศึกษาลักษณะรูปร่างของโคโลนีหรือเซลล์ของแบคทีเรีย (cell or colony morphology)  หรือต้องการนับจำนวนโคโลนีของแบคทีเรียนั้น  ต้องมีการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียบนอาหารแข็ง (solid medium) ที่อยู่ในจานอาหาร (petri dishes)  ดังนั้นอาหารที่อยู่ในจานควรเป็นอาหารที่ปลอดจากเชื้อชนิดอื่น   เพื่อป้องกันไม่ให้เชื้อจุลินทรีย์ที่ปนเปื้อนมามีการเจริญกลบทับเชื้อจุลินทรีย์ที่ต้องการเพาะเลี้ยงการเทอาหารที่แข็งที่อยู่ในขวดผ่านการฆ่าเชื้อเสร็จเรียบร้อยแล้วให้นำออกจากเครื่อง autoclave   แช่ขวดอาหารในอ่างน้ำควบคุมอุณหภูมิ (water bath) ที่มีอุณหภูมิ 50°C เป็นการป้องกันไม่ให้อาหารแข็งตัว   เนื่องจากอาหารแข็งมีวุ้นเป็นองค์ประกอบจะเริ่มแข็งตัวที่อุณหภูมิประมาณ 40°C    ถ้าอาหารในขวดผ่านการฆ่าเชื้อและเก็บไว้เป็นเวลาหลายวัน เมื่อจะนำมาเทลงในจานให้นำขวดอาหารมาแช่ในอ่างน้ำเดือดเพื่อให้อาหารหลอมเหลว   เมื่อต้มจนแน่ใจว่าวุ้นหลอมเหลวหมดแล้ว   จึงค่อยนำมาแช่ในอ่างน้ำควบคุมอุณหภูมิที่มีอุณหภูมิ 50°C ต่อไป          อุณหภูมิของอาหารที่เหมาะสมที่จะเทลงในจานคือประมาณ 45°C (มือเปล่าสามารถจับขวดได้  ห้ามใช้ผ้าหรือกระดาษห่อขวดระหว่างเท  จะเป็นการเปิดโอกาสให้เชื้อจุลินทรีย์ปนเปื้อนได้ง่ายระหว่างการเท)   การเทอาหารที่มีอุณหภูมิสูงเกิน 50 °C จะทำให้เกิดหยดน้ำบนฝาจานเป็นจำนวนมากจนไหลนองบนผิวอาหาร ผิวหน้าอาหารแห้งยาก  เมื่อนำมาเพาะเชื้อจุลินทรีย์จะไม่ได้โคโลนีเดี่ยวๆ   ทำให้ไม่สามารถได้เชื้อบริสุทธิ์   การเทอาหารที่มีอุณหภูมิต่ำกว่า 45°C   ทำให้อาหารเริ่มแข็งตัว   มีก้อนวุ้นเกิดเป็นหย่อมๆ ไม่สามารถเทได้ 

อุปกรณ์

1.      ขวดเปล่า 1 ใบ (ไม่ต้องฆ่าเชื้อจุลินทรีย์)
2.      จานเปล่า (petri dish) 4ใบ (ไม่ต้องฆ่าเชื้อจุลินทรีย์)
3.      ตะเกียง
4.      อาหาร NA ที่ผ่านการฆ่าเชื้อบรรจุในขวด 1 ขวด
5.      จานเปล่าผ่านการฆ่าเชื้อ 4 ใบ6.      ตะเกียง

วิธีการ

1.      เช็ดโต๊ะด้วยน้ำยาฆ่าเชื้อ
2.      นำขวดใส่น้ำประปาและปิดฝา
3.      นำจานมาวางใกล้ตะเกียงและจุดไฟ
4.      ฝึกการเทน้ำใส่จานด้วยเทคนิคปลอดเชื้อโดยมีขั้นตอนดังนี้
4.1  เปิดฝาขวดและลนไฟที่ปากขวด   อีกมือหนึ่งเปิดฝาแง้มไว้  ขณะเดียวกันค่อยๆเทน้ำลงไปในจาน ฝึกเทน้ำให้ไหลไปในจานโดยที่ไม่ไหลไปตามข้างขวด  จะเป็นสาเหตุให้มีการปนเปื้อนเชื้อจุลินทรีย์จากข้างขวดลงไปในจานอาหารได้   ระหว่างเทน้ำลงไปในจานปากขวดต้องไม่สัมผัสกับสิ่งใดๆ
4.2  เมื่อเทจนน้ำไหลไปใกล้จะเต็มพื้นที่ก้นจาน   ให้หยุดเท (การเทเช่นนี้จะได้ปริมาณอาหารในจานประมาณ 15-20 มล.)
4.3  ฝึกการหมุนจานเพื่อช่วยให้อาหารไหลไปจนเต็มพื้นที่ก้นจาน  ต้องฝึกหมุนโดยไม่ให้น้ำกระเด็นเปื้อนฝาจาน หรือหกออกนอกจาน     ขณะที่หมุนจานนั้นปากขวดจะถูกจ่อใกล้ๆไฟ    เพื่อป้องกันไม่ให้มีการปนเปื้อนเชื้อจุลินทรีย์จากอากาศลงไปในขวด
4.4  หยิบจานเปล่าอีกใบซ้อนบนจานที่เพิ่งเทน้ำ  แล้วเทน้ำลงไป  ทำเช่นเดียวกับข้อ 4.1-4.4   ทำจนครบทั้ง 4 ใบ
4.5  ให้นักศึกษาหมุนเวียนกันฝึก    โดยผลัดกันทำ   และช่วยกันดูความผิดพลาดของแต่ละคน     เมื่อฝึกจนชำนาญแล้ว     จึงปฏิบัติจริงด้วยอาหารและจานที่ปลอดเชื้อจุลินทรีย์ในการทดลองข้อที่ 55        ให้เทอาหาร NA ลงในจาน โดยมีขั้นตอนเช่นเดียวกับข้อ 4.1-4.4 6        เลื่อนจานทั้งแถวเบาๆออกไปไว้ข้างๆโต๊ะ  อย่าให้อาหารกระเด็นมาบนฝาจานหรือหกออกนอกจาน   จะเป็นเหตุให้ปนเปื้อนเชื้อจุลินทรีย์จากภายนอกได้ง่าย   ขณะที่วุ้นกำลังแข็งตัวต้องระมัดระวังไม่ให้กระเทือนเพราะจะทำให้ผิวหน้าอาหารไม่เรียบ7        ทิ้งไว้จนอาหารแข็งตัว คว่ำจาน แล้วนำไปใส่ในตู้อบ 35-37 °C ค้างคืนเพื่อทำให้ผิวหน้าแห้ง  วันรุ่งขึ้นให้ตรวจดูอาหารในจานว่าเป็นอย่างไร 
การทดลองที่ 2    การฝึกเทคนิคการถ่ายเชื้อจุลินทรีย์จากหลอดหนึ่งไปยังอีกหลอดหนึ่งด้วย                 loop และ needle (Aseptic  tube Transfer) (คลิกดู slide)  (คลิกดู video)

อุปกรณ์

1.      หลอดทดสอบพร้อมจุก  ไม่ต้องผ่านการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์
2.      loop
3.      Rack ใส่หลอดทดสอบ
4.      Serratia marcescens อายุ 18 – 24 ชั่วโมง บน NA slant
5.      Nutrient agar slant 3 หลอด (ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว)
6.      เชื้อรา Aspergillus sp.
7.      PDA slant 2 หลอด8.      Needle ซึ่งปลายเข็มงอเป็นรูปตัว L


วิธีการ

          ให้นักศึกษาฝึกเทคนิคถ่ายเชื้อจุลินทรีย์จากหลอดทดลองหลอดหนึ่งลงสู่อีกหลอดหนึ่งด้วยวิธีปลอดเชื้อ
1.      นำหลอดทดสอบ 2 หลอด ไปเติมน้ำประปาและปิดจุก   หลอดหนึ่งเขียนข้างหลอดว่า A อีกหลอด B
2.      ให้ลองฝึกเทคนิคการถ่ายเชื้อจุลินทรีย์จากหลอด A ไปยังหลอด B ด้วย loop    ให้ทำดังต่อไปนี้
- เผา loop บริเวณลวดนิโครมจนร้อนแดง
- ถือ loop ไว้รอจนกระทั่งเย็น (ระหว่างรอให้ loop เย็น ต้องระวังไม่ให้ loop แตะสิ่งใดๆ     จะทำให้เชื้อจุลินทรีย์กลับปนเปื้อนบน loop อีก)
- เมื่อ loop เย็นแล้ว  ให้ใช้มืออีกข้างหยิบหลอดทดสอบ A ออกจาก Rack
- ใช้นิ้วก้อยและอุ้งมือที่จับ loop เปิดฝาหลอดทดสอบ  โดยระหว่างเปิดฝาหลอด   ปากของฝาหลอดต้องไม่สัมผัสอุ้งมือ  ให้ปากของฝายื่นออกจากอุ้งมือดังแสดงในภาพ
- ลนปากหลอดทดสอบ A
- นำหลอดทดสอบ A ออกจากเปลวไฟ แต่ยังคงอยู่ใกล้ ๆ ตะเกียง   แล้วใช้ loop จุ่มลง  ไปในของเหลวที่อยู่ในหลอด A
- นำ loop ออกจากหลอด   ของเหลวจะติดเป็นฟิล์มเต็ม loop
- ลนไฟปากหลอดทดสอบ A แล้วปิดฝา
- มือข้างที่ไม่ได้ถือ loop หยิบหลอดทดสอบ B ออกจาก Rack
- ใช้นิ้วก้อยและอุ้งมือของมือที่จับ loop เปิดฝาหลอดทดสอบ โดยระหว่างเปิดฝาหลอด   ปากของฝาหลอดทดสอบต้องไม่สัมผัสกับอุ้งมือเช่นเดียวกัน
- ลนปากหลอดทดสอบ B
- นำหลอดทดสอบ B ออกจากเปลวไฟ แต่ยังคงอยู่ใกล้ ๆ กับตะเกียง แล้วใช้ loop ที่มี  ฟิล์มเชื้อติดอยู่แล้วจุ่มลงไปในหลอดทดสอบ B แล้วเอา loop ออกจากหลอดทดสอบ
- ลนไฟปากหลอดทดสอบ B แล้วปิดฝา
- เผา loop จนร้อนแดงเพื่อกำจัดเชื้อจุลินทรีย์ที่ติดมากับ loop
ให้นักศึกษาฝึกปฏิบัติทุกคน โดยผลัดกันปฏิบัติและผลัดกันตรวจสอบดูความถูกต้องของเทคนิค  ให้ฝึกจนมีความชำนาญ ถูกต้องและรวดเร็ว แล้วจึงค่อยทำการทดลองจริงในข้อ 3 ต่อไป
3.      ให้ถ่ายเชื้อ Serratia marcescens ลงไปบน Nutrient agar slant ตามเทคนิคที่ได้ฝึกมา      ในข้อ 1 และ 2
4.      ต้องระมัดระวังไม่ขูดเชื้อจนผิววุ้นกระจาย  ให้ใช้ loop แตะเชื้อเพียงเล็กน้อย และเวลาถ่ายเชื้อลงบน NA slant อีกหลอด   ให้ใช้วิธี streak คือ ขีด loop  เบาๆไปบนผิวหน้าของอาหารเป็นรูปฟันปลา 
5.      บ่มหลอดทดสอบที่ถ่ายเชื้อแล้วที่ 35 – 37 oC ประมาณ 18 –24 ชั่วโมง6.      ตรวจดูลักษณะเชื้อจุลินทรีย์บนผิวหน้า slant   เชื้อ Serratia marcescens เป็นเชื้อ     จุลินทรีย์ที่สร้างเม็ดสี (pigment)  มีสีแดง  ทำให้ช่วยสังเกตได้ง่ายว่าเทคนิคการถ่ายเชื้อดีพอหรือไม่   โดยดูจากลักษณะรูปร่างของโคโลนีบน slant ว่ามีสีแดงเหมือนกันทั้งหมดทั้งผิวหน้าหรือไม่   ถ้าเทคนิคดีลักษณะรูปร่างเชื้อเป็นอย่างไร
7.      ให้นักศึกษาถ่ายเชื้อ Aspergillus sp. ลงไปใน PDA slant ตามวิธีที่ฝึกมาในการเขี่ยเชื้อราต่างกับเชื้อแบคทีเรีย   needle ที่ใช้จะเป็น needle ปลายเข็มงอเป็นรูปตัว L   เวลาเขี่ยเชื้อให้ใช้เข็มตัดเอาวุ้นตรงบริเวณที่มีเส้นใยราออกมา   ใช้ปลายเข็มปักก้อนวุ้นนั้น แล้วจึงค่อยนำออกมาจากหลอด เมื่อจะถ่ายเชื้อราที่อยู่บนก้อนวุ้นใส่ใน slant    ให้วางก้อนวุ้นนั้นบนผิวของอาหารโดยไม่ต้อง streak8.      บ่มเชื้อที่อุณหภูมิ 35 – 37 oC   เป็นเวลา 7 วัน9.      เมื่อครบกำหนด ตรวจสอบดูเทคนิคการถ่ายเชื้อรา   ถ้าเทคนิคปลอดเชื้อดี  ลักษณะเส้นใยและสปอร์บนผิว slant จะเหมือนกันหมด 
การทดลองที่ 3     การฝึกเทคนิคการใช้ Serological pipette ด้วยวิธีปลอดเชื้อ (Aseptic      transfer technique by Serological pipette) (คลิกดู slide)         
งานด้านจุลชีววิทยาต้องใช้ Serological pipette เพื่อดูดสารละลายหรือเชื้อจุลินทรีย์ในอาหารเหลวด้วยปริมาตรที่ต้องการแบบปลอดเชื้อ ดังนั้นนักจุลชีววิทยาจึงต้องเรียนรู้เทคนิคการใช้ Serological pipette ด้วยวิธีปลอดเชื้อ  โดยเรียนรู้ตั้งแต่ขนาดของ Serological pipette และการเลือกใช้ขนาดของ Serological pipette ให้เหมาะสมกับปริมาตรที่ต้องการดูด  ศึกษาเครื่องช่วยดูด pipette  วิธีการจับหลอด การเปิดปิดหลอดขณะดูดถ่ายเชื้อจุลินทรีย์ หรือสารละลายด้วย Serological pipette          ขนาดของ Serological pipette ที่ใช้ประจำในงานจุลชีววิทยาคือ 1 มล. และ 10 มล.   ถ้า pipette ผลิตจากบริษัทเดียวกันแถบสีตรงบริเวณปลายที่ใช้ดูดจะมีสีต่างกัน  เพื่อให้เห็นความแตกต่างของปริมาตร pipette ได้ง่ายขึ้นขณะใช้งาน          pipette ขนาด 1 มล. จะมีข้อความ “1 in 1/100 ml” ตรงปลายที่ใช้ปากดูด หมายถึง pipette 1 มล. ถูกแบ่งเป็นช่องเล็กสุดแต่ละช่องมีปริมาตร 0.01 มล. (1/100 มล.)   หรือหนึ่งช่องใหญ่ (สังเกตดูขีดยาวที่มีตัวเลขกำกับ) จะเท่ากับ 0.1 มล.          Pipette ขนาด 10 มล. จะมีข้อความ “10 in 1/10 ml” ตรงปลายปากที่ใช้ดูด หมายถึง pipette 10 มล. ถูกแบ่งเป็นช่องเล็กสุดแต่ละช่องมีปริมาตร 0.1 มล. (1/10 มล.)          เครื่องหมายบน pipette ที่ต้องทราบอีกอย่างคือ วงแหวน   ถ้ามีวงแหวนที่ปลายบริเวณปากดูดแสดงว่าเป็น pipette ชนิดที่ต้องเป่า (blow-out pipette) คือไม่ว่าจะเป็น pipette ชนิด 1 มล. หรือ 10 มล.  ถ้าต้องการดูดสารละลาย 1 มล. ด้วย pipette ชนิด 1 มล. หรือต้องการ 10 มล. ด้วย pipette ชนิด 10 มล.   เมื่อปล่อยสารละลายออกแล้วต้องเป่าให้สารละลายที่ค้างที่ปลาย pipette ออกไปด้วยจึงจะได้ปริมาณที่ถูกต้อง แต่ถ้าที่ปลายบริเวณปากดูดไม่มีวงแหวนแสดงว่า pipette ประเภทนั้นตรงปลาย pipette ด้านที่ปล่อยสารจะไม่ได้แบ่งปริมาตรไว้   ดังนั้นเมื่อปล่อยสารออกไปจึงไม่มีปัญหาเรื่องสารค้างที่ปลาย pipette จึงไม่ต้องเป่า (ดูรูปประกอบ)          การเลือกขนาดของปิเปตให้เหมาะสมกับปริมาตรที่ต้องการดูดเป็นสิ่งสำคัญ ปริมาตรที่ต้องการดูดได้น้อยที่สุดจะเท่ากับ 1 ใน 10 ของปริมาตรทั้งหมดของปิเปต จึงจะมีความแม่นยำ เช่น ต้องการดูดสาร 0.1 มล. ต้องใช้ปิเปต ขนาด 1 มล.   หากใช้ 10 มล. ดูดสารเพียง 0.1 มล. ปริมาณสารที่ต้องการดูดน้อยกว่า 1 ใน 10 ของปริมาตรทั้งหมดของปิเปต  ทำให้มีความละเอียดไม่เพียงพอ          pipette ที่จะใช้ในงานจุลชีววิทยาต้องผ่านการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ โดยการนำ pipette บรรจุลงในกระป๋อง ปิดฝา แล้วนำไปฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ใน Hot air oven ที่อุณหภูมิ 180 oC 2 ชม.   เมื่อจะใช้ pipette ให้ลนไฟที่ปากกระป่อง  เปิดออกแล้ววางบนโต๊ะ  โดยให้ปากกระป๋องยื่นออกจากขอบโต๊ะ และฝากระป๋องให้วางข้าง ๆ กระป๋องดังภาพ  ควรจัดให้ pipette ในกระป๋องมีปลายที่ใช้ปากดูดอยู่ในระดับต่าง ๆ กัน  โดยใช้ฝากระป๋องครอบ pipette หลวม ๆ แล้วกระแทกเบา ๆ  การที่ปลาย pipette มีระดับต่าง ๆ กัน  ทำให้มือไม่สัมผัสถูก pipette อันอื่นๆซึ่งช่วยป้องกันไม่ให้มีการปนเปื้อนเชื้อจุลินทรีย์จากมือลงไปยัง pipette อันอื่นๆ  มือต้องจับตรงปลายด้านที่ใช้ปากดูด  ส่วนบริเวณปลายอีกด้านต้องระมัดระวังไม่ให้สัมผัสกับสิ่งใดๆ  เพราะจะทำให้เกิดการปนเปื้อนเชื้อจุลินทรีย์จากสิ่งที่ pipette สัมผัส   เมื่อ pipette มีการสัมผัสกับสิ่งต่างๆ  ให้เปลี่ยน pipette ทันที    pipette ที่ผ่านการดูดเชื้อจุลินทรีย์ให้วางในราง pipette ที่มีน้ำยาฆ่าเชื้อจุลินทรีย์เพื่อป้องกันไม่ให้เชื้อจุลินทรีย์กระจายไปในสิ่งแวดล้อม<span style="font-size: 16pt; fon