How to set a new panel of fluorescent based STR-PCR ? 2: What should we do with a fluorescent primer?

     ว่าไปแล้ว ผมได้รับ fluorescent primer สำหรับการ set autosomal STR เพิ่ม มานานกว่า 1 เดือนแล้วล่ะ แต่ระหว่างนี้ ค่อนข้างวุ่นวายไปกับเรื่องไม่เป็นเรื่อง ที่ต้องใช้เวลา สารพัด  วันๆ ไม่รู้หมดไปกับอะไร ที่ดูเหมือนไม่ค่อยได้งานเป็นชิ้นเป็นอันมากนัก แต่ก็ต้องทำ นี่เพิ่งจะได้เวลา มาจัดการเรื่องการ set autosomal STR เพิ่ม

     คราวนี้ มาว่ากันด้วยเรื่องของ primer ครับ

1. ต้องเจือจาง primer เท่าไหร่ เพื่อใช้เป็น stock concentration กะ working concentration ?

     เจ้า PCR primer นี่เท่าที่ผมจำได้ และคุ้นเคยด้วย คือตัวเลข 100 กะ 20  เลข สองตัวนี้ คือ concentration ที่จะต้องใช้ในการจัดการกะ primer ครับ  ไม่ว่าเราจะสั่ง primer ไปด้วยความเข้มข้นเท่าใดก็ตาม แต่พอมาถึงเรา เราก็ต้องเจือจางให้ได้ความเข้มข้น 100 pmol/ul เป็น stock concentration แล้วเวลาจะใช้งาน ก็ต้องเจือจาง ให้ได้ความเข้มข้น 20 pmol/ul

     แล้วที่ผ่านมา เวลาสั่งซื้อ primer ในเอกสารแนบมากับ primer นั้น เขามักจะบอกไว้ด้วยว่า ต้องเจือจางด้วย TE buffer ลงไปเท่าใดจึงจะได้ความเข้มข้น 100 pmol/ul  ซึ่งค่อนข้างสะดวกครับ เพราะเราไม่ต้องคำนวณอะไร เพียงแค่ตรวจสอบกับเอกสารกำกับ ที่แนบมากับ primer ก็รู้แล้วล่ะ

     แต่ เจ้า fluorescent primer ที่สั่งไปกับบริษัท gene plus ซึ่งส่งต่อให้ทาง Applied Biosystems ผลิตให้นั้น เขาไม่ได้บอกไว้ในเอกสารกำกับ ที่ส่งมาด้วย รายละเอียดในนั้นที่มีอยู่ ก็เพียง ปริมาณ primer ที่สังเคราะห์ เท่ากับ 10,000 pmol  ทีนี้ก็ต้องมาคำนวณล่ะครับว่าต้องเติม TE buffer ลงไปเท่าไหร่

     คำนวณง่ายๆครับ เราต้องการ stock ความเข้มข้น 100 pmol/ul  ขณะที่ fluorescent primer ที่สังเคราะห์ไปนั้น มีปริมาณ 10,000 pmol  ดังนั้น เราต้องเติม TE buffer ลงไป = 10,000/100    = 100 ul ครับ  

     แล้วเวลาจะใช้ ก็เตรียมให้เป็น working 20 pmol/ul นั้นคือต้องนำมาเจือจางด้วย TE buffer อีก 5 เท่า

     กรณีทั่วไป ที่ใช้งานกับ SinglePlex PCR หรือทำ autosomal STR PCR เพียงตำแหน่งเดียว ให้ใช้วิธีการคำนวณ ข้างบนนั้น แต่ตอนนี้ เราไม่ได้ทำ SinglePlex PCR สิ่งที่เราต้องการคือ เราจะทำเป็น multiplex PCR  คือทำ PCR พร้อมกันคราวละหลายๆตำแหน่ง และเป้าหมายของเราที่จะทำในคราวนี้ คือเราต้องการทำ PCR พร้อมกัน 10 ตำแหน่งในหลอดทดลองเดียวกัน ดังนั้น เราต้องมาจัดการกะ stock และ working concentration ของ fluorescent primer ครับ

    ในหลักการแล้ว การทำ PCR ต้องมี working PCR primer ไม่น้อยกว่า 10 pmol/ul ครับ 

     ทีนี้ เราต้องการทำ multiplex PCR 10 loci คิดเป็น primer ทั้งหมด 20 ข้าง นั่นหมายความว่า ถ้าเราผสม primer เป็น pool primer หลอดละเท่าๆกัน จะเป็นการเจือจาง primer = 20 เท่า  

     เริ่มต้นหากเราเตรียม stock primer ของเรา ให้ได้ 100 pmol/ul ให้เท่ากับการทำ SinglePlex PCR ทั่วไป แล้วเอามา pool primer หลอดละเท่าๆกัน เราจะเหลือ final working primer เท่ากับ 100/20  = 5 pmol/ul ซึ่งค่อนข้างน้อยครับ   (จริงๆแล้วควรเจือจางให้ได้ final concentration อย่างน้อยประมาณ 10-20 pmol/ul)  เพราะฉะนั้น ในกรณีนี้ เราจึงเลือกเจือจาง stock primer ให้ได้ความเข้มข้นมากกว่าปกติ คือแทนที่จะเจือจางเป็น 100 pmol/ul เราก็เจือจางให้ได้ 200 pmol/ul โดยการเติม TE buffer ลงไปหลอดละ 50 ul  ทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง ประมาณ 15 นาที และพยายามหลีกเลี่ยงกับการสัมผัสโดยตรงกับแสง เนื่องจากสาร fluorescein มักเป็นสารที่มีความไวต่อแสง ครับ  จากนั้นผสมให้เข้ากัน  แล้วดูด primer เหล่านี้ มาหลอดละ 5 ul มาทำเป็น pool PCR primer เราก็จะได้ pool primer 5x20 = 100 ul

    2. PCR primer ควรเจือจาง ด้วย น้ำกลั่น หรือ TE buffer ดี

     primer มันก็เป็น single strand DNA โดยทั่วไปเรามักคุ้นเคยกับการเจือจาง ดีเอ็นเอด้วย น้ำกลั่น หรือ TE buffer ก็เลยมักเป็นคำถาม ที่คนมักถามกันว่าจริงๆแล้ว ควรเจือจาง ดีเอ็นเอด้วย น้ำกลั่นหรือ TE buffer ดี แล้วเอาเข้าจริงๆ ก็มีคนเจือจางดีเอ็นเอ ด้วยทั้ง น้ำกลั่น และ บางคนก็เจือจางด้วย TE buffer  ซึ่งก็ใช้ได้ทั้งคู่ครับ

     แต่ถ้ามาว่ากันในหลักการ

     ดีเอ็นเอ ละลายได้ดีทั้งใน น้ำกลั่น และ TE buffer ครับ

     แต่ในน้ำกลั่น ไม่มีสารอื่นใด ที่ช่วย preserve ตัวดีเอ็นเอไว้  ดังนั้นถึงแม้ดีเอ็นเอจะละลายได้ดี แต่การเก็บดีเอ็นเอไว้ในระยะยาว ควรเก็บไว้ในตัวทำละลายที่มีสารช่วย preserve ไว้ด้วยครับ  ซึ่งการเก็บดีเอ็นเอไว้ระยะยาว จึงควรเก็บใน TE buffer ดีกว่า

     ดังนั้น การละลาย primer จึงควรละลายด้วย TE buffer ครับ

     3. TE buffer ช่วยเก็บดีเอ็นเอระยะยาว ได้อย่างไร

     TE buffer เตรียมได้จาก 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0  เจ้าสารนี้ประกอบด้วย Tris กะ EDTA โดย Tris ทำหน้าที่เป็น buffer ซึ่งช่วยป้องกันการเปลี่ยนแปลงค่า pH ของสารน้ำ  และ EDTA ทำหน้าที่เป็น Chelating agent คือเป็นสารที่มีคุณสมบัติจับได้กับโลหะ หมู่ 2+ ที่เราใส่ EDTA ลงไป ก็ด้วยเหตุผลว่า ไม่ว่าจะเป็น enzyme ที่ใช้ในการสร้างดีเอ็นเอ หรือ ทำลายดีเอ็นเอ ก็ตาม การทำงานของ enzyme เหล่านี้ จำเป็นต้องมี Mg2+ เป็น cofactor ด้วยเสมอ ดังนั้น เจ้า EDTA จะมีหน้าที่จับกับ โลหะหมู่ 2+ ซึ่งก็คือ Mg2+ ทำให้ enzyme เหล่านี้ไม่สามารถทำงานได้ ดังนั้นจึงเป็นการ preserve ดีเอ็นเอได้ในระยะยาวครับ

     แล้วถ้าเราใส่ TE buffer ที่มีส่วนผสมของ EDTA ลงไป  เวลาที่เรานำดีเอ็นเอนี้ไปทำ PCR ซึ่งเป็นการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในหลอดทดลอง ซึ่งจะต้องมีการเติม Mg2+ ลงไปด้วย เจ้า EDTA ก็จะไปกำจัด Mg2+ ด้วย ทำให้เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอไม่ได้  เหตุการนี้มักเกิดขึ้น ในการทำ PCR ที่เติม ดีเอ็นเอลงไปปริมาณมากๆ  

     วิธีแก้ไข เพื่อป้องกันปัญหานี้ ก็เลยมีการเตรียม TE buffer ขึ้นมาอีกสูตรหนึ่ง เรียกว่า low salt TE buffer โดยเตรียมให้ EDTA มีความเข้มข้นน้อยลงไป 10 เท่า โดยเตรียมดังนี้ครับ    10 mM Tris, 0.1 mM EDTA pH 8.0  

     แล้วก็มีคนเอา low salt TE buffer นี้ไปใช้ในการละลาย primer ครับ  ก็ใช้ได้ครับ แต่ในหลักการแล้ว เรามักจะใส่ primer ลงไปใน reaction ปริมาณคงที่ทุกครั้ง ไม่ได้ปรับเปลี่ยนปริมาณเหมือนกับ ปริมาณ DNA template ครับ ดังนั้น การละลาย primer จึงควรใช้ TE buffer ปกติ จะดีกว่าครับ

     เรื่องที่ว่าด้วย การจัดการกะเจ้า flourescent primer ก็น่าจะจบลงด้วยประการฉะนี้ครับ