สกัดดีเอ็นเอ ง่ายๆ ด้วย chelex

1. เริ่มต้น มารู้จักกันก่อนว่า เจ้า chelex มันคืออะไร 

       เจ้า chelex ที่ใช้ในงานสกัดดีเอ็นเอ มีชื่อจริงว่า imminodiacetic acid ชื่อเล่นๆ ที่เรียกกันโดยทั่วไปมีชื่อว่า Chelex 100 มันเป็น chelating resin คำว่า chelate หมายความว่า มันมีคุณสมบัติในการจับได้กับโลหะหมู่ 2+ อย่างเช่น Ca2+, Mg2+ และอื่นๆที่มีประจุ 2+ อีกมากมายครับ

2. แล้วเจ้า chelex มันสกัดดีเอ็นเอได้อย่างไร

   วิธีการสกัดดีเอ็นเอจากเซลล์ โดยทั่วไปต้องเริ่มจากการทำให้เซลล์แตกก่อน ซึ่งมักใช้เอ็นไซม์ proteinase K หรือ protease ก็ได้ทำการย่อยเซลล์เมมเบรนและนิวเคลียร์เมมเบรนซึ่งมีโปรตีนเป็นส่วนประกอบ  เมื่อเซลล์เมมเบรนและนิวเคลียร์เมมเบรนแตกแล้ว ก็จะปล่อยให้เจ้าดีเอ็นเอออกมาล่องลอยอยู่ภายนอก โดยทั่วไปแล้วภายในเซลล์ก็จะมีเอ็นไซม์ที่ใช้ในการสร้างดีเอ็นเออย่างเช่น polymerase หรือเอ็นไซม์ที่ใช้ในการทำลายดีเอ็นเอ อย่างเช่น nuclease เอ็นไซม์เหล่านี้ไม่ว่าจะใช้สร้างดีเอ็นเอหรือทำลายดีเอ็นเอก็ตาม  ต่างก็มีเจ้า Mg2+ เป็น cofactor ซึ่งหมายความว่า เอ็นไซม์เหล่านี้จะทำงานได้ จำเป็นต้องมี Mg2+ ร่วมอยู่ด้วยเสมอครับ หากแยกจากกันเมื่อไหร่ ถึงแม้มีเอ็นไซม์ไปก็บ่ลักครับ มันไม่มีแรงทำงานหรอกครับ เมื่อเราใส่ chelex เข้าไป เจ้า chelex ของเรา ก็มีหน้าที่เข้าไปจับกับ Mg2+ เมื่อ Mg2+ หายไปหมดแล้ว ถึงแม้ในหลอดของเราจะมีเอ็นไซม์ที่ใช้ทำลายดีเอ็นเออยู่มันก็ไร้ค่าครับ เพราะคู่หูไม่อยู่แล้ว ยังไงมันก็ทำงานไม่ได้ ดีเอ็นเอของเราก็อยู่รอดปลอดภัยครับ หลังจากนั้นก็นำไปต้มที่ 100 องศาเซลเซียส การต้มนี้จะเป็นการทำลายเอ็นไซม์ proteinase K หรือ protease ทำให้เราไม่ต้องไปเสียเวลาแยกมันออกจากดีเอ็นเอครับ แล้วการต้มก็เป็นการทำลายโปรตีนด้วยทำให้โปรตีนพวกที่เป็น heat labile หมายถึงโปรตีนพวกที่ไม่ทนต่อความร้อนก็ถูกทำลายไปด้วย เราก็ไม่ต้องไปเสียเวลาแยกโปรตีนออกจากดีเอ็นเอครับ เมื่อต้มเสร็จ ก็นำไปใช้ได้เลยครับ 

3. แล้วเตรียมน้ำยากันยังไง

     น้ำยาที่ใช้มีอยู่แค่ตัวเดียวครับ คือ 5% chelex ในน้ำกลั่นครับ เวลาเตรียม ก็แค่ชั่ง chelex มา 1 กรัม เติมน้ำกลั่นลงไป 20 มิลลิลิตร เขย่าให้เข้ากัน ก็ใช้ได้เลยครับ

     มีห้องแล็บบางแห่งใช้ความเข้มข้นสูงถึง 50% chelex ในน้ำกลั่นครับ แต่จะใช้เท่าไหร่ไม่ใช่เรื่องสำคัญ แค่เพียงขอให้มี chelex มากเพียงพอที่จะดูดซับ Mg2+ ก็ถือว่าใช้ได้ครับ พี่สุทัศน์ที่เชียงใหม่เคยสอนผมว่า ใส่ chelex ลงไปให้เม็ด bead มากพอที่จะท่วมตะกอนเซลล์ทั้งหมด นี่ก็เป็นข้อสังเกตที่ดีครับ

4. น้ำยาที่เตรียมแล้ว ใช้งานได้นานแค่ไหน

     เจ้า 5% chelex ในน้ำกลั่นนี้ โดยทั่วไปก็ควรใช้ให้หมดภายใน 1 เดือนครับ ดังนั้นการเตรียมใช้งานแต่ละครั้งจึงไม่ควรเตรียมมากมายเป็นลิตรครับ เตรียมให้เพียงพอที่จะใช้หมดใน 1 เดือน แล้วค่อยเตรียมใหม่ก็ได้ เพราะวิธีการเตรียมก็ไม่ได้วุ่นวายอะไร แต่ถ้าไม่อยากทิ้ง ก็มีข้อสังเกตครับ ปกติแล้วน้ำยา chelex ที่เตรียมในน้ำกลั่นจะมี pH ประมาณ  10-11 หากค่า pH เปลี่ยนแปลงไปไม่อยู่ในช่วงนี้ อย่าพยายามปรับ pH ครับ ให้ทิ้งไปได้เลยแล้วเตรียมใหม่ดีกว่า

5. วิธีสกัดล่ะ ทำอย่างไร

     วิธีการสกัดดีเอ็นเอขึ้นกับตัวอย่างตรวจครับ ตัวอย่างตรวจคนละชนิดก็มีวิธีการทำที่แตกต่างกัน ในที่นี้ ผมขอกล่าวถึงเฉพาะวิธีการสกัดดีเอ็นเอจากตัวอย่างเลือด และเซลล์กระพุ้งแก้ม ซึ่งเป็นวิธีที่ใช้เป็นงานประจำของหน่วยนิติเวชศาสตร์และพิษวิทยา ภาควิชาพยาธิวิทยา คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์ ซึ่งเป็นวิธีการที่ผ่านการปรับปรุงขั้นตอนการทดสอบจาก original protocol มาแล้วครับ

     การสกัดดีเอ็นเอจากตัวอย่างเลือดครบ (EDTA blood)

1. ดูดเลือด 30 ul ใส่ในหลอด eppendorf 

2. เติมน้ำกลั่นประมาณ 1.5 ml ใส่ลงในหลอด ตั้งไว้ที่อุณหภูมิห้องนาน 3-5 นาทีเพื่อให้เซลล์เม็ดเลือดแดงแตก

3. นำไปปั่นที่ความเร็ว 8,000 รอบต่อนาที นาน 1 นาที แล้วเทน้ำใสออกให้มากที่สุด (เหลือตะกอนเซลล์เม็ดเลือดขาวอยู่ที่ก้นหลอด)

4. เติมน้ำกลั่น ประมาณ 1.5 ml ผสมให้เข้ากันโดยการคว่ำหลอดไปมา แล้วนำไปปั่นที่ความเร็ว 8,000 รอบต่อนาที นาน 1 นาที เทน้ำใสออกให้มากที่สุด

5. เติม 5% chelex 100 ul ลงไปในหลอด เขย่าเบาๆ 

6. นำไปต้มที่อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส นาน 12 นาที

7. ตั้งไว้ให้เย็นที่อุณหภูมิห้อง ผสมให้เข้ากัน จากนั้นนำไปปั่นที่ความเร็ว 8,000 รอบต่อนาที นาน 1 นาที นำน้ำใสส่วนบนไปวัดปริมาณดีเอ็นเอ หรือจะนำไปเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยวิธี PCR ได้เลยครับ

     การสกัดดีเอ็นเอจากเซลล์กระพุ้งแก้ม

1. เติมน้ำกลั่น ประมาณ 1 ml ลงในหลอด eppendorf 

2. นำไม้พันสำลีที่เก็บตัวอย่างเซลล์กระพุ้งแก้ม มาเขย่า หมุนๆ ในน้ำกลั่น ให้เซลล์ออกจากไม้พันสำลีให้มากที่สุด สังเกตได้ว่า หากมีเซลล์ออกมามาก น้ำจะขุ่นมาก หากมีเซลล์น้อย น้ำจะขุ่นน้อยครับ

3. นำไปปั่นที่ความเร็ว 8,000 รอบต่อนาที นาน 1 นาที จะเห็นตะกอนเซลล์สีขาวตกอยู่ด้านล่างของหลอดพลาสติก เทน้ำออกให้มากที่สุด

4. เติม 5% chelex 100 ul ลงไปในหลอด 

5. เติม proteinase K 10 ul ลงไปในหลอด ผสมให้เข้ากัน โดยการดูดเป่าขึ้นลง ให้เซลล์ฟุ้งกระจายออกมาให้มากที่สุด

6. นำไปอุ่นที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส  นาน 30 นาที (ตรงนี้ขึ้นกับชนิดของ proteinase K ครับ ว่ามีอุณหภูมิที่เหมาะสมในการทำงานที่เท่าไร บางยี่ห้อ อาจใช้อุณหภูมิ 56 องศาเซลเซียสครับ แต่โดยทั่วไปก็ประมาณ 50-65 องศาเซลเซียส)

7. นำไปต้มที่อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส นาน 12 นาที

8. ตั้งไว้ให้เย็นที่อุณหภูมิห้อง ผสมให้เข้ากัน จากนั้นนำไปปั่นที่ความเร็ว 8,000 รอบต่อนาที นาน 1 นาที นำน้ำใสส่วนบนไปวัดปริมาณดีเอ็นเอ หรือจะนำไปเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยวิธี PCR ได้เลยครับ

     เห็นไหมว่าวิธีการสกัด ไม่ยุ่งยากเลย ใช้น้ำยาไม่มาก น้ำยาราคาไม่แพง แถมยังสามารถทำได้ในเวลารวดเร็ว

 6. แล้วมีข้อควรระวังอะไรบ้างล่ะ

• วิธีการสกัดดีเอ็นเอด้วยวิธี chelex นี้ เราจะได้ดีเอ็นเอสายเดี่ยว (single strand DNA) ครับ ดังนั้นการวัดปริมาณดีเอ็นเอด้วยวิธีการดูดกลืนคลื่นแสง (spectrophotometry) ที่ความยาวคลื่น 260 นาโนเมตร ต้องคูณด้วย factor  33 ครับ ไม่ใช่ 50 เหมือนในดีเอ็นเอสายคู่ (double strand DNA) แล้วการที่มันเป็นดีเอ็นเอสายเดียว ทำให้มันไม่เหมาะกับการนำไปใช้ทำ restriction fragment length polymorphism (RFLP) ซึ่งจำเป็นต้องใช้ดีเอ็นเอสายคู่ครับ
• เจ้า chelex มันเป็นเม็ด bead มีขนาดเม็ดใหญ่พอสมควร ดังนั้นการใช้ autopipette ในการดูด ควรใช้ pipette tip สีฟ้า ครับ หรือใช้ autopipette ขนาดสัก P1000
• ก่อนใช้ต้องเขย่า ให้เม็ด bead กระจายตัวให้ทั่วครับ หมั่นเขย่าบ่อยๆ เพราะมันนอนก้นได้เร็ว
• ดีเอ็นเอที่สกัดได้ หากเก็บไว้ใช้ไม่นาน ควรเก็บที่ 4 องศาเซลเซียส ก็เก็บไว้ได้ไม่ควรเกิน 1 เดือน โดยไม่ต้องแยกเม็ด chelex ออก แต่ถ้าหากต้องการเก็บไว้นานเกินกว่า 1 เดือน ผู้ผลิตเขาแนะนำว่าควรปั่นแยก chelex ออกครับ แล้วเก็บน้ำใส freeze ไว้ที่ -20 องศาเซลเซียส ทั้งนี้เนื่องจากเม็ด bead มีโอกาสที่จะ break down ทำให้เจ้า inhibitor ที่ถูกจับไว้ ถูกปล่อยออกมายับยั้งปฏิกิริยาเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอครับ แต่เท่าที่ผมเคยทำโดยการจับทั้งหลอด freeze  ไว้ที่ -20 องศาเซลเซียส โดยไม่แยกเม็ด chelex ออก  ผ่านไป 3 ปี เอาออกมาทดสอบก็ยังเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้โดยไม่มีปัญหาครับ

7. แล้วมันราคาสักเท่าไรกัน 

     ที่หน่วยงานผมใช้ Chelex 100 ของ BIO-RAD เป็นชนิด Molecular biology grade 200-400 mesh, Sodium form ขนาด 50 g., Cat.No. 142-1253 ซื้อไว้เมื่อปี 2545 ตอนนั้นราคา 3,745 บาท รวมภาษีมูลค่าเพิ่มเรียบร้อยแล้ว แต่ตอนนี้ไม่ทราบว่าราคาเท่าไหร่แล้วครับ

[nutty]

ขอบคุณมากๆนะคะ

ได้ความรู้เพิ่มขึ้นเยอะเลยค่ะ ^^