มาต่อกันหน่อยค่ะ จากเอกสารที่เขียนไว้เพื่อการอบรมเชิงปฏิบัติการ Realtime PCR and its applicationsรู้ข้อดีข้อด้อยของ Realtime PCR ตอนที่แล้ว คราวนี้ก็มาดูต่อถึงสิ่งที่เกี่ยวข้องในปฏิกิริยาของเขาสักหน่อย
สิ่งที่เกี่ยวข้องใน Real-time PCR
- PCR product ที่มีการ label ด้วยสารเรืองแสง(fluorophore)
- Primer และ probe ที่ออกแบบเพื่อให้ได้ปฏิกิริยาที่มีประสิทธิภาพ (Efficiency) มากที่สุด
- เมื่อนำสัญญาณในช่วง exponential phase ของแต่ละ cycle มา plotใน log scale ดังรูป จะสามารถคำนวณ PCR efficiency ได้ = [10(-1/slope)-1]
- สูตรเหล่านี้เพียงรู้ไว้เป็นพื้นฐาน ไม่ต้องจำเลย เพราะเครื่อง Real-time PCR แต่ละชนิดจะมี software จัดการให้เราหมดefficiency ของ PCR ควรมีค่าอยู่ที่ 100 -90% (ideal slope = -3.322 ซึ่งเป็น100%efficiency คือการที่ได้จำนวนเพิ่มเป็น 2 copy ทุกรอบในขณะที่หาก slope = -3.462, efficiency จะเท่ากับ 1.95 นั่นคือได้ 1.95 copy/cycle)
- มี variable หลายตัวที่มีผลต่อ efficiency ของ PCR เช่น ความยาวของ amplicon, secondary structure และการออกแบบ primer
เรื่องราวตั้งแต่ต้นๆของบทความชุดนี้ ตามไปดูได้นะคะ ที่
- (1) PCR คืออะไร
- (2) ขั้นตอนพื้นฐานของ PCR
- (3) ธรรมชาติของปฏิกิริยา PCR
- (4) Real-time PCR คืออะไร
- (5) ความแตกต่างระหว่าง Conventional กับ Real-time PCR
- (6) ข้อดีและข้อด้อยของ Real-time PCR
ดาวน์โหลดเอกสารทั้งฉบับได้ตรงนี้เลยค่ะ Basic RealTime PCR
ขอบคุณค่ะ เพราะตอนแรก search จาก paper ต่าง ๆ ดูแล้วส่วนใหญ่เค้าใช้ของที่บริษัทผลิตออกเป็นชุดสำเร็จรูป หรือไม่ก็ใช้ SYBR green น่ะค่ะ ขอบคุณอีกรอบค่ะ
ลองไปเปิดดูแล้วค่ะ ได้ primer ที่เป็น probe taqman มาแล้วค่ะ แต่มีอยากสอบถามความเห็นพี่โอ๋น่ะค่ะ คือไม่แน่ใจว่า target gene organism เป็น Mus musculus แต่คือต้องการใช้กับ human cell น่ะค่ะ
ถ้าลอง blast primer นี้ใน human gene แล้วมันมีส่วนที่ตรงกัน 100% มันจะสามารถนำ primer นี้มาใช้ได้หรือไม่ค่ะ
แต่จะลองไปหาข้อมูลเพิ่มเติมอีกน่ะค่ะ
ขอบคุณค่ะ
ต้องลอง BLAST ดูนะคะ ถ้าตรงกับ human 100% ก็น่าจะใช้ได้ค่ะ
พี่โอ๋คะ คือ ตอนนี้ที่คณะเค้าตัดสินใจซื้อเครื่อง real time ที่เป็น life cycler 480 ของ Roche น่ะค่ะ เห็นพี่โอ๋ก็บอกว่ามันดีกว่าของอันอื่น อันนี้หนูก็ยังไม่เคยลองใช้ แต่ฟังจากเซลล์แต่ละบริษัทแล้ว ดูของ Roche มันน่าจะดีกว่าจริง ๆ แต่ราคามันแพงกว่ามาก ก็เลยอยากลองถามพี่ว่า ของเค้าดีจริงใช่มั้ยคะ แต่หนูจะทำ gene expression ด้วยน่ะค่ะ ถ้าไม่สะดวกตอบบนหน้าจอ รบกวนพี่ตอบทางเมล์ได้ไหมคะ
ขอบคุณค่ะ
สวัสดีค่ะ คือนู๋ทำ real time แล้วไม่ได้ Sigmoid curve ที่เหมาะสมคือช่วง Linear สั้นมาก เป็นเพราะอะไรได้บ้างคะ ต้องแก้ไขยังไง
เสียดายที่สองคำถามนี้ผ่านตาไปตั้งนาน และไม่ได้มาจากการเข้าระบบ แต่อาจจะมีเมลไปถามโดยตรงมาแล้ว เพราะได้รับการปรึกษาเรื่องแนวนี้เยอะมาก ถ้าเรื่องไหนมีประโยชน์โดยรวมจะมาตอบเป็นบันทึกใหม่เลยนะคะ ถ้าเป็นเฉพาะกรณีก็แค่แก้กันไปเป็นรายๆ