รายละเอียดการทำ 2 large overlap PCR product fragments

เลือก amplify  2 เส้นใหญ่ก่อน ได้แก่ 4F27R และ 26F5R

Primer sequence

4F: AAGCATAATATAGCAAGGACTAACC ตำแหน่งที่ 1814-1838

27R: ATAGAGAGGTAGAGTTTTTTTCGTG ตำแหน่งที่ 11028-11052

26F: CGGCTTCGACCCTATATCC ตำแหน่งที่ 10175-10193

5R: CCATAGGGTCTTCTCGTCTTG ตำแหน่งที่ 2713-2733 

 

ขั้นตอนการทำ PCR

รายละเอียด	ปริมาณ
DW	31 ul
5xBuffer GC	10 ul
dNTP (ABI) 2 mM each	5.5 ul
primer (each)	1+1 ul
Phusion enzyme	0.5 ul
DNA template	1 ul

 

PCR condition for 4F27R

Program STMT4F  เครื่อง PCR No 1

step	Temperature	Time
1	98C	30 S
2	98C	10 S
3	66C	30 S
4	72C	6 Min
5	Goto step 2 for 35 additional cycles
6	72C	10 Min
7	4C	5 Min

PCR condition for 26F5R

Program STMT26E  เครื่อง PCR No 5

step	Temperature	Time
1	98C	30 S
2	98C	10 S
3	72C	6 Min
4	Goto step 2 for 35 additional cycles
5	72C	10 Min
6	4C	5 Min

run electrophoresis using 0.5% agarose gel (100 ml 0.5x TAE buffer + agarose 0.5 g)

run 100 V 30 min

use 1 kb marker as a ladder

 หมายเหตุ ใช้ Agarose type I ของ sigma Cat No A6013-500G