อาจารย์คะ เมื่อหนูได้คู่ของ primerมาแล้วหลายๆคู่ แล้วหนูจะ detect ว่าprimerคู่ไหนที่สามารถพบยีนตัวที่หนูต้องการ ที่หนูควรเลือกคู่นั้นมาออกแบบprimerจริงๆ หนูอยากทราบว่ามีโปรแกรมไหนบ้างคะที่สามารถทำได้

เข้าไปที่ BLAST  ของ NCBI แล้วก็เลือก database ที่ตรงกับของเรา (Human, mouse, rat ตามที่เขามี) แล้วก็เอา primers เราใส่เข้าไป เขาจะมีผลออกมาให้ว่า sequence ที่เราใส่ match กับ gene อะไรมากแค่ไหนค่ะ

อยากสอบถามอาจารย์ค่ะ คือเมื่อหนูได้ไพรเมอร์จากโปรแกรม primer3 แล้วค่ะ ขั้นต่อไปคือหนูจะตรวจสอบ คู่ไพรเมอร์นั้นว่าจะสามารถ detectยีนตัวนี้ ในแบคทีเรียสปีชีร์อื่นอีกไหม หนูสามารถใช้โปรแกรมไหนตรวจสอบคู่ไพรเมอร์นั้นได้อีกบ้างคะ นอกจาก primer blast

น่าจะดูได้ที่ MBGD (Microbial Genome Database for Comparative Analysis) นะคะ เขามี homology search ให้ใส่ sequence ตรวจสอบดูได้ แต่ถ้าดูจากเว็บของ NCBI ที่ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/ ก็คิดว่า BLAST ของเขาก็น่าจะครอบคลุมนะคะ

อยากทราบว่าถ้า forward and reward Primer มีค่า Tm ต่างกัน จะทำอย่างไรในการตั้งค่าอุณหภูมิของ step ที่ 2 (annealing) จะใช้เท่าไรดูจากตัวแปรไหนบ้าง ค่ะ

เดี๋ยวนี้มักจะมีที่คำนวณให้ค่ะ เช่นที่ https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator ได้ผลอย่างเดียว มีบางที่มีให้เลือกปรับ และมีข้อมูลว่ามายังไงไปยังไงเช่น http://www.promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm ถ้าเป็นทฤษฎีก็น่าจะหาอ่านไม่ยากนะคะ (แต่ว่าเป็นภาษาอังกฤษ) ใส่คำที่ถามมานี่แหละค่ะ

สวัสดีค่ะอาจารย์หนูก็เป็นอีกคนที่ทำ PCR แล้วไม่เห็น band PCR ค่ะ โดยหนูก็ลองปรับเปลี่ยนตั้งแต่ ปริมาณ MgCl2 รวมถึงปรับเปลี่ยน annealing ให้เหมาะสม (primer เป็น universal primer ค่ะ 8UA และ 1492Rค่ะ) และหลังจากสกัดดีเอ็นแล้วหนูก็ check แล้วนะคะว่ามีดีเอ็นเอ และก็เห็นดีเอ็นเอชัดเจนค่ะ หนูอยากขอคำแนะนำจากอาจารย์ด้วยค่ะว่าจะมีวิธีแก้ไขปัญหานี้อย่างไรได้บ้างคะ ขอบพระคุณล่วงหน้าค่ะ

หนู aew ลองเอา sequence ของทั้งสอง primers มาลงพร้อมทั้ง condition ที่ใช้ทั้งหมดใน mastermix และเซ็ตติ้งต่างๆตอนทำ PCR มาลงให้ดูด้วยสิคะ ถึงจะพอประเมินได้ว่าน่าจะเป็นเพราะอะไร

mastermix ที่ใช้ประกอบด้วย DW.for pcr   13 ul, buffer(ที่มี MgCl 15mm)     2.5 ul, MgCl 50 mM 0.5 ul, dNTP 2.0 ul, primer อย่างละ 2.5 ul, DNA template 2.0 ul และ taq polymerase 0.2 ul รวมแล้วได้ 25 ul คำนวณไม่รวมtaq นะคะ นอกจากนี้หนูได้ลองปรับโดยยึดการเปลี่ยนแปลงของ การเติมและไม่เติม MgCl ค่ะ ส่วนประกอบอื่นยังคงเหมือนเดิมค่ะแต่เพิ่มลดตรงปริมาณน้ำ ส่วน condition pcr คือ initial 95 องศา นาน 15 นาที, 35 รอบ ของ 94 องศา นาน1 นาที, annealing 50 องศา นาน 2 นาที, 72 องศา นาน 1.30 นาที และ final step คือ 72 องศา นาน 10 นาทีค่ะ นอกนั้นก็มีการปรับเปลี่ยนตาม paper ที่อ่านแล้วเขาใช้ได้กับเชื้อ bifidobacteria ค่ะ พอดีหนูสกัดดีเอ็นเอจากเชื้อ bifidobacteria ค่ะ ส่วนตรงที่ปรับก็จะเป็น condition ของ annealing ค่ะ ตั้งแต่ 48, 50, 52, 55,58 และ 60 องศาค่ะ ซึ่งปรับเปลี่ยนcondition ของการทำ pcr และสารประกอบที่ทำ mastermix หนูลองทำประมาณอาทิตย์นึงเลยรู้สึกเครียดเลยค่ะ ลืมบอกค่ะหนูเคยเห็น band ครั้งเดียวของการทำ pcr ที่เคยลองสภาวะที่ส่งให้อาจารย์ดูข้างต้นค่ะแต่หลังจากนั้นก็ไม่เคยเห็นเลยค่ะ ในส่วน sequnce ของทั้งสอง primer หนูค่อยส่งให้อาจารย์ดูอีกทีนะคะ ขอบพระคุณล่วงหน้ากับคำแนะนำค่ะ

อีกอย่างนะคะ หนูไม่สะดวกในการพิมพ์ค่ะพอดีหนูพิมพ์กับมือถือไม่ได้เอาคอมมาขออภัยล่วงหน้าด้วยนะคะอาจารย์หนูกลับถึงมหาวิทยาลัยแล้วหนูจะส่ง sequence ให้อาจารย์ดูนะคะ

ดูคร่าวๆ annealing ดูน่าจะต้องดูจาก sequences ของ primer อีกทีค่ะว่าควรใช้เท่าไหร่ และหนูลองเช็คดูซิคะว่าตอนที่เห็น band นั้นยใช้ condition อันไหน บอกมาอีกทีพร้อม sequence นะคะ อย่าเพิ่งท้อ เพิ่งเริ่มต้นเองค่ะ 

condition ที่ใช้นะคะ initial 95 องศา นาน 15 นาที, 35 รอบ ของ 94 องศา นาน 1 นาที, annealing ที่ 50 องศา นาน 2 นาที , 72 องศา นาน 1.30 นาที และ final step 72 องศา นาน 10 นาที ค่ะ ส่วน primerที่ใช้ คือ 8UA และ 1492R sequence สำหรับ 8UA คือ 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' และ 1492R 5'-TACGGGTACCTTGTTACGACTT-3'ค่ะ

ลืมบอกค่ะ condition ที่หนูส่งก่อนหน้านี้เป็น conditionที่เคยเห็น band ค่ะ

ถ้าหนูจะเข้ามาหาพี่ ช่วยหยิบรูปถ่ายเจลที่เห็น band กับเอา paper ที่หนูมีเกี่ยวกับ condition เข้ามาด้วยนะคะ โทรนัดได้ตามเบอร์ที่อยู่ในเมลนะคะ โทรสายในมาก่อนก็ได้ค่ะ (1563)

ได้ค่ะ ขอบคุณค่ะ

รบกวนสอบถามอาจารย์หน่อยนะคะ คือ หนูทำบริสุทธิ์ ด้วยวิธี gel purify อ่ะค่ะ แล้วพอนำมาทดสอบโดยการ run gel อีกครั้งนึงเพื่อจะส่ง sequecing  ปรากฎว่า ไม่พบแถบแบรนด์ เลยสักแถบเดียวค่ะ หนูอยากทราบว่า สาเหตุของการที่ไม่พบแถบแบรนด์เลย มาจากสาเหตุใดได้บ้างคะ และอยากทราบว่าสาเหตุส่วนหนึ่งนั้นเกี่ยวกับการตัดเจลรึป่าวคะ รบกวนอาจารย์ช่วยแนะนำหนูหน่อยนะคะ ขอบคุณค่ะ

คุณ Whan คะ ข้อมูลน้อยไปหน่อย เดาไม่ถูกเลยค่ะว่าน่าจะเป็นเพราะอะไร เช่นว่าวิธีที่ทำ gel purification นี่ใช้อะไร purify มีการวัดปริมาณ DNA ดูหรือเปล่าคะว่ามีเท่าไหร่ ตอน run gel ออกมาได้แบนด์ (ไม่ใช่แบรนด์ เพราะมันคือ band นะคะ) ขนาดแค่ไหน บางทีเวลาจะเอาไปส่ง sequencing อาจต้อง run มากกว่า 1 sample ก็มีนะคะถ้าความเข้มข้นมันน้อยไป มีคนโพสต์ปัญหานี้กันเหมือนกันค่ะ ลองอ่านได้ที่ http://www.biotechniques.com/BiotechniquesJournal/2010/September/DNA-and-General-PCR-Gel-Purification-of-PCR-Products/biotechniques-302438.html

http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/6925.html

http://www.researchgate.net/post/PCR_of_a_gel-extracted_product

เผื่อจะได้ไอเดียว่าปัญหาของหนูเหมือนแบบไหนนะคะ 

รบกวนสอบถามค่ะ
หนูมีการบ้านชิ้นนึงที่อาจารย์สั่งมาคะ

คืออาจารย์ให้มาหา Gene ที่ใช้ในการจำแนกแบคทีเรีย แล้วให้บอกประโยชน์ของมันคะ
กำลังเรียนเรื่อง Phylogenetic tree อยู่คะ

หนูพยายามหาแล้วแต่ไม่เจออะไรที่นอกจาก 16s rRNA เลยคะ
รบกวนช่วยตอบด้วยนะคะ ว่ามีนอกเหนือจากนี้มั้ยคะ ^_^

ไม่ค่อยเข้าใจคำถามนะคะ ว่าใส่หลาย sequence หมายความว่าอะไร เพราะถ้าใส่หลาย sequence แล้วจะหา primers ให้อันไหน ฟังแล้วงงงงค่ะ แต่ก็ลองไปหาดูให้ตามบันทึก เว็บไซต์รวมแหล่งสำหรับใช้ในการออกแบบ PCR primers นะคะ ถ้ามีอะไรให้ช่วยเพิ่มเติมก็ถามมาอีกได้นะคะ

สวัสดีค่ะอาจารย์ หนูมีข้อส่งสัยในการทำ PCR และ real - time PCR คะ

1. PCR สามารถทำหลอดเดียว โดยใส่ promer หลายคู่ได้ไหมค่ะ 2.Real-time PCR หนูลองทำ standard 5 เส้น แต่ละส้น dilute ลง 10 เท่า แล้วปรากฏว่า แต่ละเส้น เส้นที่ 1,2,3 ขึ้นสวย แต่เส้นที่4,5 ไม่สวย คือจำนวนรอบใกล้กันเกิดนไป เส้นไม่เป็น S cruve บ้าง หนูควรแก้ไขปัญหาอย่างไรค่ะ

ขอบคุณล่วงหน้าค่ะ

เท่าที่รู้ยังไม่มีค่ะ

สวัสดีค่ะอาจารย์

หนูมีข้อสงสัย รบกวนถามอาจารย์หน่อยค่ะ

คือ ตอนนี้หนูกำลังทำ PCR เกี่ยวกับ microsatellite ค่ะ ซึ่งตอน varies condition สามารถ amplified PCR ได้แล้วค่ะ ซึ่งตอนลองใช้ sample 4 ตัวอย่าง แต่พอตอนที่ทำจริงๆ มีตัวอย่างทั้งหมด 94 ตัวอย่าง (ซึ่งไม่ได้เอา 4 ตัวอย่างที่เคย amplified ขึ้นมาทำด้วย) ปรากฎว่า run gel แล้วไม่เห็น band ใดเลยค่ะ ทำ 2 ครั้ง reaction ละ primer ได้ผลเหมือกัน คือไม่เห็น band ใดๆ เลยสงสัยว่าเกิดจากอะไรได้บ้างคะ

ไม่ทราบว่าการทิ้ง master mix ที่ใส่ Taq แล้วไว้นานจะเป็นผลมั้ยคะ เพราะตอนทำใส่ master mix ก่อน template ค่ะ แต่วาง plate ไว้บน ice box อีกที ค่ะ

ขอบคุณล่วงหน้าค่ะ

สวัสดีค่ะอาจารย์

รบกวนถามเกี่ยวกับการทำ qPCR ด้วย SYBR Green หน่อยค่ะ การที่จะใช้ไพรเมอร์ที่มีขนาด product ประมาน 300-400 bp สามารถทำได้มั้ยคะ หรือจะต้องน้อยกว่า 200 bp เท่านั้น

รบกวนด้วยนะคะ

ขอบคุณค่ะ

ปัญหาของคุณ Noname IP: xxx.155.170.138 กว้างไปนะคะ มีปัจจัยหลายอย่างที่เป็นไปได้ จำไม่ได้ว่าทำไมไม่ได้ตอบก่อนหน้านี้ อาจจะได้ดูรายละเอียดจากเมลโดยตรงไปแล้ว

ส่วนของคุณ siraprapa เป็นคำถามที่มีคนสงสัยและถามผ่าน www.researchgate.net เยอะอยู่นะคะ ผู้เชี่ยวชาญที่เขาทำๆกันอยู่ก็บอกว่าเป็นไปได้ค่ะ เพียงแต่อาจจะมีปัญหาหลายอย่างกว่า เช่นโอกาสเกิด non-specific product, ทำ quantification ยากกว่า (ซึ่งส่วนมากเราทำ qPCR เพื่อหาปริมาณอยู่แล้ว) เป็นต้นค่ะ ต้องทดลองดูค่ะว่าสำหรับ product ของเราทำได้มั้ย เพราะนอกจากปัญหาพื้นฐานพวกนี้แล้ว ที่สำคัญต้องดูว่า product และ template ของเรา sequence น่าจะมีปัญหาด้วยไหมอีกน่ะค่ะ

สวัสดีค่ะ

เนื่องจากหนูศึกษาอยู่ชั้นปีที่ 4 ทำโปรเจคเกี่ยวกับมาลาเรีย ออกแบบ primer ที่จำเพาะต่อยีน cox-3 โดยใช้ multiplex PCR ผลกาารทำ PCR คือ positive control ไม่ขึ้นเลยสัก band เห็นแต่ primer dimer ส่วน band ของ sample นั้น ขึ้น 3 band ทั้งๆที่ควรจะขึ้น band เดียว ซึ่งได้ทำซ้ำกันสองครั้งก็ยังให้ผลเช่นเดิม เคยปรับลดอุณหภูมิของ annealing แล้วค่ะ แต่ผลก็ไม่เวิร์ค อาจารย์พอจะมีคำแนะนำอย่างอื่นไหมคะ พอดีลองนำ primer ไป blast แล้ว ก็ specific ดี เลยไม่อยากจะออกแบบใหม่อ่ะค่ะ

หนุงหนิง คะ control positive ของหนูคืออะไรคะ น่าสงสัยว่าทำไมถึงไม่ขึ้น

การ blast ดูนั้น น่าจะต้องตรวจสอบดูด้วยนะคะว่า specific ดีกับสิ่งที่เราต้องการ แล้วมี sequences อื่นๆใดอีกมั้ยที่มีเปอร์เซ็นต์ match สูงๆใกล้เคียงกัน เพราะถ้ามีและ condition ที่หนูตั้งไว้มันเผอิญไปเหมาะกับกลุ่มพวกนั้น ก็อาจจะทำให้มี product ก็ได้นะคะ เพราะน่าสงสัย condition ที่ใช้จากการที่ไม่มี product จาก positive control แต่ได้ primer dimer น่ะค่ะ

รบกวนสอบถามหน่อยนะคะอาจารย์ พอดีหนูทำแลปPCR เเล้วตกตกกอนดีเอ็นเอด้วย PEG-8000+MgCl2 ผลคือ ได้ขนาดเเบรนตรงตามที่ต้องการค่ะ เเต่เมื่อหนูลองเอาดีเอ็นที่ผ่านการตกด้วย PEG มาใช้เป็น template เริ่มต้นใหม่ในการทำPCR ผลปรากฏว่าไม่เห็นเเบรน เกิด smear band เเทน ทั้งนี้มีสาเหตุมาจากอะไรได้บ้างค่ะ รบกวนอ.ด้วยนะ

อรไพลินคะ เท่าที่ลองหาดูให้ในพวก forum ที่เขาถามๆกัน คิดว่าน่าจะเป็นเพราะ product ที่ได้มันมีปริมาณน้อยมากจนไม่พอที่จะเป็น template ในการทำ PCR ได้ อาจจะต้องหาวิธีเพิ่มจำนวน copy number ให้มากขึ้นกว่านี้มังคะ อันนี้ไม่เคยทำจริงๆ แค่ลองอ่านๆดู เรียกว่าเป็นการเดาคำตอบให้จริงๆค่ะ

คือหนู Run Gel ออกมาปรากฏว่า มีแบนเกิดขึ้น แต่เป็นคลื่นๆ ไม่เป็นเส้นตรง แต่แบนของDNA ladder ก็เป็นเส้นตรงน่ะค่ะ หนูควรแก้ปัญหาอย่างไรดีค่ะ

คุณตุ้ย...ออกจะแปลกนะคะ ต้องขอดูภาพหน่อยว่าที่ว่าคลื่นนั้นเป็นยังไงค่ะ มีกี่เลนและเป็นทุกเลนเลยหรือเปล่าคะ เลนของ DNA ladder ที่ว่าตรงนั้นอยู่ตรงไหนของแผ่น gel ต้องพิจารณาหลายๆสิ่งแวดล้อมถึงจะหาสาเหตุที่น่าจะเป็นได้ค่ะ

อาจารย์ค่ะ ถ้ารันเจล (ทำCO1 ค่ะ) แล้วแบนไม่ขึ้น แบบไม่สเมียร์เลยอ่ะค่ะ พอจะมีวิธีแก้ไขยังไงค่ะ อาจารย์พอจะมีเปเปอร์แนะนำให้แก้ไขได้ไหมค่ะ

แบนไม่ขึ้นก็แปลว่าไม่มี product เลย ถ้า mastermix OK ก็ต้องเป็น template ว่าความเข้มข้นเท่าไหร่ มากน้อยไปหรือเปล่า มีอะไรที่ interfere การทำ PCR หรือเปล่าน่ะค่ะ หาคำตอบของปัญหาพื้นๆนี้ก่อน

ขอสอบถามค่ะอาจารย์ พอดีหนูทำ conventional PCR 5 sample แล้ว Beta actin ขึ้นไม่เท่ากันในแต่ละ sample ค่ะ ควบคุมปริมา RNA template ให้เท่ากันแล้ว และลองเปลี่ยน annealing temp กับ cycle แล้วก็ยังไม่เท่ากัน ถ้าตัด human error ออกไป ไม่ทราบว่าการที่ Beta actin ขึ้นไม่เท่ากันนี่เกิดได้จากสาเหตุอะไรบ้างคะ แล้วจะต้องแก้ไขอย่างไรบ้าง ขอบคุณมากค่ะ

นึกถึงคุณภาพ RNA น่ะค่ะ หนูวัดปริมาณ RNA ด้วยวิธีไหนคะ ต้องเช็คดูว่ามี contaminate ไหมด้วยนะคะ คุณภาพ RNA มีผลให้ beta actin ไม่เท่ากัน เราจึงต้องใช้ beta catin เป็นตัว normalized ผลนี่เองค่ะ ลองตรวจสอบคุณภาพของ RNA ดูด้วยนะคะ

ขอสอบถามหน่อยค่าอาจารย์ คือว่าหนูทำ PCR แล้วมารันเจลอะกาโรสพบว่าได้แบนด์ที่มีขนาดใหญ่เกินกว่าปกติอ่ะค่ะ แล้วคือรัน12ตัวอย่างพบว่าขนาดใหญ่เกินปกติทั้งระบบเลย คือปกติอยู่ที่ไม่เกิน1000 แต่ว่าหนูทำได้2000กว่าเลยอ่ะค่ะ มันมีสาเหตุจากอะไรได้บ้างค่ะ ขอบคุณมากค่ะ

ขนาดที่ว่านี่หมายถึงอะไรคะ ขนาดของ product หรือเปล่าคะ 1000bp หรืออย่างไร ไม่เข้าใจค่ะ แล้ว product ที่หนูต้องการคือขนาดเท่าไหร่ ไม่เข้าใจคำถามเลยค่ะ ถ้ายังไงส่งภาพเจลมาด้วยน่าจะเข้าใจมากขึ้นนะคะ

ขนาดของ Product ค่ะ ภาพอยู่ในลิ้งค์นี้เลยค่ะ https://www.img.in.th/image/lE... คือที่หนูไปหาเปเปอร์มาตำแหน่ง IL-1A ที่หนูทำการเพิ่มจำนวนปกติมันขนาดไม่เกิน 1000 bp อ่ะค่ะ แต่หนูทำแล้วได้พันกว่าถึงสองพันแทบหมดเลย

ขนาดของ Product ค่ะ ภาพอยู่ในลิ้งค์นี้เลยค่ะ https://www.img.in.th/image/lE... คือที่หนูไปหาเปเปอร์มาตำแหน่ง IL-1A ที่หนูทำการเพิ่มจำนวนปกติมันขนาดไม่เกิน 1000 bp อ่ะค่ะ แต่หนูทำแล้วได้พันกว่าถึงสองพันแทบหมดเลย

หนูไร่อ้อยแห้งเฉา คะ แสดงว่า product ที่ได้ไม่ใช่ product ที่หนูต้องการแน่เลยค่ะ ต้องไปลองเอา primers ที่ใช้ใส่โปรแกรม BLAST ที่ https://blast.ncbi.nlm.nih.gov... ดูว่ามันสามารถ amplify อะไรได้อีก เพราะถ้าขนาดไม่ใช่ก็ไม่น่าจะใช่ product ที่ต้องการละค่ะ อาจจะต้องปรับ condition ให้เหมาะสมมากขึ้นเพื่อให้จำเพาะกับ product ที่เราต้องการ amplify หรืออาจจะออกแบบ primers ใหม่เลยที่จำเพาะกว่าค่ะ

สวัสดีค่ะ อาจารย์ หนูขอสอบถามหน่อยค่ะ พอดีสั่งstock primer จากบริษัท แล้วเราต้องมาละลายไพร์เมอร์เพื่อนำมาใช้ เราควรใช้สารตัวไหนในการละลายprimer ดีค่ะ และแต่ละไพร์เมอร์เราจะใช้สารละลายจำนวนเท่าไหร่ดูตรงไหน และทราบได้อย่างไรค่ะ