การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ
การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ( Media Preparation ) การศึกษารูปร่างโครงสร้างหรือคุณสมบัติต่างๆของจุลินทรีย์นั้น จะศึกษาจากตัวอย่างของจริงจากธรรมชาติแต่เพียงอย่างเดียวนับว่ายังมีไม่เพียงพอ จึงจำเป็นจะต้องนำจุลินทรีย์มาเลี้ยงและขยายพันธุ์เพิ่มจำนวนในอาหารเลี้ยงเชื้อให้มีปริมาณมากพอที่จะใช้ศึกษาเพื่อสังเกตลักษณะต่างๆเพิ่มมากขึ้น อาหารซึ่งใช้เลี้ยงจุลินทรีย์นั้น อาจมีลักษณะทางกายภาพหลายลักษณะ เช่น- Solid media (agar) คือ อาหารเลี้ยงเชื้อที่มีการเติมวุ้นลงไป ตามปกติจะเติม 15 กรัมต่อลิตรอาหาร ในการเลี้ยงเชื้อจุลินทรีย์ solid media จะอยู่ในจานแก้ว (petri dish) หรืออยู่ในหลอดทดสอบซึ่งมีผิวหน้าเอียงเรียก slant หรือ slope อาหารในหลอดทดสอบที่ผิวหน้าไม่เอียงเรียก deep tube เพื่อใช้เลี้ยงจุลินทรีย์ที่ต้องการออกซิเจนในการเจริญเพียงเล็กน้อย - Semisolid media คือ อาหารเลี้ยงเชื้อจุลินทรีย์ที่เติมวุ้นลงไปปริมาณต่ำกว่า solid media คือ ประมาณ 0.5% หรือน้อยกว่า- Liquid media (Broth) คือ อาหารเลี้ยงเชื้อจุลินทรีย์ที่ไม่ได้เติมวุ้นลงไป ดังนั้นอาหารจึงเป็นของเหลว เช่น Nutrient broth เป็นต้น
อาหารเลี้ยงเชื้อนั้นสามารถแบ่งตามส่วนประกอบทางเคมีได้เป็น 2 พวกคือ
1. Natural or chemically non-defined media
เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่เราไม่รู้ส่วนประกอบทางเคมีที่แน่นอน เช่น อาหารเลี้ยงเชื้อที่ได้
จากธรรมชาติ เช่น มันฝรั่ง หรืออาหารที่ประกอบด้วย peptone, yeast extract, meat infusion, serum, beef eatract หรือ casein hydrolysate2. Synthetic or Artificial or Chemically define mediaเป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่รู้ส่วนประกอบทางเคมีที่แน่นอนว่าประกอบด้วยสารอะไรอย่างละเท่าใด สามารถจะเตรียมได้เหมือนกันทุกครั้งซึ่งมีทั้งชนิดที่เป็น inorganic salt ต่างๆ และชนิด organic synthetic media เช่น รู้ว่าอาหารแต่ละชนิดประกอบด้วย amino acid อะไรบ้าง อย่างละเท่าใด เป็นต้น นักจุลชีววิทยาจะสามารถใช้อาหารที่เหมาะสมต่อการใช้งานได้ เราสามารถแบ่งประเภทของอาหารตามวัตถุประสงค์ของการใช้งานได้ดังนี้
Enrichment media
เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่ได้เติมสารอาหารบางอย่างพิเศษนอกเหนือไปจากธาตุอาหารที่ จุลินทรีย์ทั่วไปใช้ ทั้งนี้เพื่อให้จุลินทรีย์ที่เราต้องการเลี้ยงเจริญได้ดียิ่งขึ้น เช่น การเติม blood serum วิตามิน หรือเติมสารสกัดที่ได้จากเนื้อเยื่อพืชหรือเนื้อเยื่อสัตว์ลงไปใน nutrient broth หรือ nutrient agar อาหารชนิดนี้ใช้สำหรับเลี้ยงจุลินทรีย์พวก fastidious heterotroph เช่น พวก pathogen ต่างๆ Selective media อาหารที่มีการเติมสารเคมีบางตัวลงใน nutrient agar เพื่อยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียบางกลุ่ม โดยที่สารนี้จะไม่ยับยั้งเชื้อกลุ่มที่เราต้องการจะเพาะเลี้ยง ตัวอย่างเช่น crystal violet ที่ความเข้มข้นบางช่วงจะช่วยยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียแกรมบวก โดยไม่มีผลต่อแบคทีเรียแกรมลบ ในทำนองเดียวกัน ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีสารคาร์บอนเป็นน้ำตาล maltose จะสามารถคัดเลือกแบคทีเรียที่ใช้น้ำตาล maltose ให้สามารถเจริญได้ โดยใช้หลักที่ว่าจะคัดเลือกเชื้อที่สามารถใช้สารประกอบอินทรีย์ที่แปลกออกไปได้อย่างง่ายๆ โดยการเติมสารเหล่านี้ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อแทนสารประกอบคาร์บอนอย่างอื่น Differential media คืออาหารที่เติมสารเคมีตัวอื่นลงไปซึ่งอาจจะมีผลต่อชนิดของเชื้อที่จะเจริญ หรือการเปลี่ยนแปลงลักษณะไปหลังจาก inoculate เชื้อและ incubate เชื้อไว้ ตัวอย่างเช่น เชื้อผสมของแบคทีเรีย inoculate ลงใน blood-agar medium แบคทีเรียบางพวกอาจจะสลายเม็ดเลือดแดง ส่วนแบคทีเรียอื่นๆไม่มีความสามารถนี้ สังเกตได้จาก clear zone รวมทั้งโคโลนีจะแสดงถึง hemolysis ทำให้สามารถแบ่งแบคทีเรียเป็นพวก hemolytic หรือ nonhemolytic bacteria จากการเจริญบนอาหารเดียวกัน ดังนั้น blood agar medium เป็นทั้งอาหาร enrich และ differential medium Assay medium คืออาหารที่มีส่วนประกอบที่ใช้ในการตรวจสอบหาวิตามินต่างๆ amino acid ต่างๆ และ anitibioticsMedia for enumeration of bacteria คืออาหารที่มีความจำเพาะเจาะจงเพื่อใช้สำหรับตรวจสอบหาปริมาณของแบคทีเรียในวัตถุอย่างใดอย่างหนึ่ง เช่น นมหรือน้ำนั้นควรจะต้องมีส่วนประกอบเป็นสารที่มีความจำเพาะของเชื้อรวมอยู่ด้วยMedia for characterization คืออาหารที่สามารถใช้จำแนกบอกถึงชนิดของจุลินทรีย์ ที่สามารถจะเจริญได้หรือสร้างสารบางอย่างที่ทำให้อาหารเปลี่ยนแปลงไป ทำให้สังเกตเห็นความแตกต่างได้Maintenance media คืออาหารที่ใช้เก็บรักษาเชื้อและลักษณะทางกายภาพของเชื้อนั้น จะต้องเป็นสารอาหารที่แตกต่างจากอาหารสูตรที่เหมาะสมต่อการเจริญของเชื้อ เพราะอาหารที่เหมาะสมต่อการเจริญของเชื้อนั้นอาจทำให้เชื้อเจริญได้ดีและตายเร็วขึ้น ตัวอย่างเช่น น้ำตาลกลูโคสที่เป็นส่วนประกอบในอาหารเลี้ยงเชื้อจะทำให้เชื้อเจริญได้ดีขึ้นและสร้างกรด รวมทั้ง metabolite อย่างอื่น ดังนั้นสูตรอาหารที่ใช้สำหรับเก็บรักษาเชื้อมักจะไม่เติมน้ำตาลกลูโคส หรือเติมในปริมาณต่ำๆ จึงเห็นได้ว่าอาหารเลี้ยงเชื้อจุลินทรีย์มีหลายชนิด ในการที่จะเลือกใช้อาหารชนิดใดนั้นขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์และความเหมาะสม โดยทั่วไปแล้ว คุณสมบัติที่สำคัญของอาหารเลี้ยงเชื้อทุกชนิดควรมีคุณสมบัติดังนี้คือ1. มีธาตุอาหารที่เหมาะสมกับการเจริญของเชื้อจุลินทรีย์และมีความเข้มข้นเหมาะสม2. มีความเป็นกรดเป็นด่าง (pH) ที่เหมาะสมกับจุลินทรีย์แต่ละชนิด3. ไม่มีสารพิษ4. ไม่มีสิ่งมีชีวิตใดๆ ปนเปื้อนอยู่ในอาหารนั้น
การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อจุลินทรีย์อาจใช้อาหารสำเร็จรูปซึ่งมีองค์ประกอบชนิดต่างๆผสมอยู่เรียบร้อยแล้ว หรือชั่งสารแต่ละชนิดที่เป็นองค์ประกอบของอาหารชนิดนั้น เมื่อชั่งอาหารเรียบร้อยแล้วให้ละลายในน้ำกลั่นปริมาตรที่ต้องการเตรียม อาหารที่จะเตรียมชั่งกี่กรัมให้อ่านจากฉลากข้างขวดเมื่อละลายอาหารในน้ำกลั่นแล้วคนให้เข้ากัน ต้มจนละลาย ปรับ pH ด้วยเครื่องหรือใช้กระดาษวัด pH ก็ได้ แล้วจึงถ่ายลงในหลอดทดสอบหรือขวด ปิดจุก แล้วนำไปทำลายเชื้อจุลินทรีย์ในหม้อนึ่งความดัน (autoclave) ต่อไป โดยใช้ความร้อน 121°C เป็นเวลา 15 นาที
อาหารเลี้ยงเชื้อจุลินทรีย์ Solid media ที่อยู่ใน petri dish ต้องเตรียมลงในขวดหรือภาชนะก่อน แล้วจึงนำไปฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ ภายหลังผ่านการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์แล้ว จึงค่อยนำมาเทลงใน petri dish (ซึ่งผ่านการอบฆ่าเชื้อด้วยความร้อนแห้งใน hot air oven 180°C 2 ชม.ด้วยวิธีปลอดเชื้อ (aseptic technique) อาหารเลี้ยงเชื้อที่เป็น slant นั้นอาหารจะถูกบรรจุลงใน test tube หรือภาชนะ แล้วนำเข้าเครื่อง autoclave เพื่อทำลายจุลินทรีย์ที่มีอยู่ในอาหาร เมื่อนำออกจากเครื่อง autoclave แล้วให้นำ rack ที่มี test tube เหล่านั้นมาวางเอียงบนท่อนไม้ จนกระทั่งอาหารเย็นก็จะเกิด slant ขึ้น ถ้าต้องการเตรียม deep agar คืออาหารเลี้ยงเชื้อจุลินทรีย์ที่ไม่มีผิวหน้าเอียง (slant) ก็ไม่ต้องเอียง rack ขณะทิ้งให้อาหารเย็น อาหารเลี้ยงเชื้อจุลินทรีย์ที่เป็น broth ให้บรรจุลงใน test tube หรือใน flask หรือในขวด (ขึ้นกับวัตถุประสงค์) ได้เลย แล้วนำเข้าเครื่อง autoclave เพื่อทำลายเชื้อจุลินทรีย์ อาหารเลี้ยงเชื้อจุลินทรีย์บางชนิดมีองค์ประกอบของสารบางตัวในอาหารที่สลายตัวได้ง่ายเมื่อผ่านความร้อน ให้แยกสารประกอบที่สลายตัวได้ง่าย เตรียมแยกต่างหาก ส่วนองค์ประกอบอื่นๆ ให้ชั่งแล้วละลายน้ำ ต้ม ปรับ pH แล้วนำเข้าเครื่อง autoclave เพื่อทำลายเชื้อจุลินทรีย์ในอาหารส่วนนี้ เมื่ออาหารส่วนนี้นำออกจาก autoclave ทิ้งให้เย็นแล้ว จึงค่อยเติมอาหารอีกส่วนลงไปด้วยวิธีปลอดเชื้อจุลินทรีย์ โดยอาหารส่วนที่ไม่สามารถผ่านความร้อนต้องนำไปกรองด้วยเครื่องกรองด้วยวิธีปลอดเชื้อ เครื่องกรองนี้จะมีแผ่นกรองที่มีรูขนาด 0.45 ไมครอน จึงทำให้เชื้อจุลินทรีย์ติดอยู่บนกระดาษกรอง อาหารที่ผ่านแผ่นกรองไปจะปราศจากเชื้อจุลินทรีย์ วัตถุประสงค์ เพื่อศึกษาเทคนิคและวิธีการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ
อุปกรณ์
1. ส่วนประกอบต่างๆของอาหาร Nutrient broth (NB) Nutrient agar (NA)2. เครื่องชั่ง กระดาษไขรองชั่ง ช้อนตักสาร (spatula)3. ภาชนะเตรียมอาหาร แท่งแก้ว กระดาษวัด pH 4. เครื่องแก้ว เช่น หลอดทดสอบ บีกเกอร์ ฟลาสก์ ขวดบรรจุอาหาร 5. สำลี กระดาษ ยางรัดของ การทดลองที่ 1 การเตรียมอาหาร Nutrient broth (NB) เตรียม nutrient broth 50 มล. โดย Nutrient broth มีสูตรของอาหารดังนี้ beef extract 3 กรัม peptone 5 กรัม น้ำกลั่น 1000 มล.1. ให้คำนวณดูว่าถ้าต้องการเตรียมอาหาร nutrient broth 50 มล. ต้องใช้สารแต่ละอย่างกี่กรัมแล้วจึงชั่งสารตามที่คำนวณได้2. ละลายส่วนประกอบต่างๆ ในน้ำกลั่น 50 มล. คนด้วยแท่งแก้วคนสาร ให้ส่วนประกอบอาหารละลายเข้ากันได้ดี หรือวางบนเตาเพื่อให้สารอาหารละลายเร็วขึ้น อาหารประเภท broth ละลายง่ายจึงไม่ต้องต้มนาน การต้มต้องการให้สารทุกตัวละลาย3. วัดความเป็นกรดหรือด่างของอาหารด้วยกระดาษวัด pH หรือเครื่อง pH meter กรณีที่มีความเป็นกรดมากเกินไป ปรับด้วย NaOH 0.1 N ถ้าเป็นด่างมากเกินไปให้ปรับ pH ด้วย HCl 0.1 N จนได้ pH 7.0 + 0.24. บรรจุอาหาร NB ลงในหลอดทดสอบ5. ปั้นสำลีปิดปากหลอดทดสอบ (ต้องฝึกวิธีปั้นจุกสำลีจนกระทั่งได้จุกสำลีที่ดีคือ จุกสำลีต้องยาวพอควร เมื่อเปิดจุกสำลีแล้ว จุกสำลีจะยังคงรูปอยู่ไม่กระจายตัวออก) วาง test tube ใน rack คลุมจุกสำลีด้วยกระดาษ เพื่อป้องกันไม่ให้จุกสำลีเปียก จะทำให้จุกสำลีขึ้นราง่าย6. เมื่อเตรียมอาหารเสร็จแล้ว ให้นำไปฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ในหม้อ autoclave ที่อุณหภูมิ 121°C นาน 15 นาที (ตามวิธีการในบทปฏิบัติการที่ 2) การทดลองที่ 2 การเตรียมอาหาร Nutrient agar (NA) การเตรียม nutrient agar 300 มล. โดย nutrient agar มีสูตรเหมือน nutrient broth ต่างกันที่เติม agar beef extract 3 กรัม peptone 5 กรัม agar 15 กรัม น้ำกลั่น 1000 มล.1. ให้คำนวณดูว่าถ้าต้องการเตรียมอาหาร NA 300 มล. ต้องใช้สารแต่ละอย่างกี่กรัม ชั่งสารตามที่ต้องการ2. ละลายส่วนประกอบต่างๆ ในน้ำกลั่น 300 มล. โดยให้ละลายวุ้นก่อนแล้วจึงใส่ส่วนประกอบอื่นๆคนให้ละลาย แล้วต้มจนกระทั่งส่วนประกอบต่างๆ ละลายเป็นเนื้อเดียวกัน การสังเกตดูว่าละลายหมดหรือไม่ให้สังเกตดูจากการเอาแท่งแก้วจุ่มลงไป ถ้ามีเม็ดๆเกาะติดแท่งแก้วขึ้นมาแสดงว่าละลายไม่หมด ถ้าละลายหมด media จะใส ไม่มีเม็ดวุ้นเกาะตามภาชนะหรือแท่งแก้ว การเตรียมอาหารที่มี agar ถ้าละลาย agar ไม่หมด จะมีผลทำให้ อาหารบางหลอด หรือบาง plate ไม่แข็งตัว และมีบางหลอด หรือบาง plate แข็งเกินไป3. ปรับ pH 7.0 + 0.2 เช่นเดียวกับ NB 4. ตวงอาหาร 100 มล. บรรจุลงในขวด อีก 200 มล. ใส่ใน test tube โดยนำออก 2 หลอดแยกออกใส่ rack ต่างหากเพื่อทำ deep tube นอกนั้นใส่ rack เดียวกัน เพื่อทำ slant 5. ปั้นสำลีใส่ปากขวดและหลอดใส่อาหาร6. เมื่อเตรียมอาหารเสร็จแล้ว ให้นำไปฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ในหม้อ autoclave ที่อุณหภูมิ 121°C นาน 15 นาที (ตามวิธีการในบทปฏิบัติการที่ 2)7. ให้นำ NB และ NA เก็บไว้อย่างละ 1 หลอด ไม่ต้องเอาเข้าเครื่อง autoclave 8. เมื่อเตรียมอาหารเรียบร้อยแล้ว ทำความสะอาดภาชนะและเครื่องมือต่างๆที่ใช้ในการเตรียมอาหาร
ภายหลังจากที่นำหลอดและขวดอาหารออกจาก autoclave แล้ว นำ rack ของ test tube ที่มี NA อยู่ และต้องการเตรียมเป็น slant วางเอียงบนท่อนไม้ (ขณะยังร้อนอยู่) แล้วทิ้งไว้จนกระทั่งเย็นและแข็งตัว จะได้ slant rack ที่จะเตรียม deep agar ไม่ต้องวางเอียง ส่วนขวดอาหารถ้าต้องการเทลงใน petri dish ให้แช่ขวดอาหารในอ่างน้ำควบคุมอุณหภูมิ (water bath) ซึ่งมีอุณหภูมิ 50-55°C รอจนกระทั่งอาหารเย็นลงประมาณ 50°C (ร้อนในระดับที่มือจับได้ ระวังอย่าให้เย็นเกินไป วุ้นจะแข็งตัวเป็นหย่อมๆ) ให้เทลงใน petri dish (ที่ผ่านการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์แล้ว) ด้วยวิธีปลอดเชื้อจุลินทรีย์ ทิ้งไว้จนกระทั่งเย็นและแข็งจึงค่อยเก็บ อาหารใน petri dish ที่เตรียมเสร็จใหม่ๆ ผิวหน้าอาหารอาจจะมีไอน้ำเกาะอยู่ จึงยังไม่สามารถนำมาใช้งานได้ ต้องนำ petri dish มาอบในตู้อบอุณหภูมิ 37°C ค้างคืน โดยคว่ำจานลง เพื่อให้ผิวหน้าแห้งและตรวจสอบดูว่าอาหารมีการปนเปื้อนเชื้อจุลินทรีย์หรือไม่ จึงจะสามารถนำมาใช้งานได้ ห้ามอบนานเกินไปจะทำให้อาหารแห้งเชื้อจุลินทรีย์จะไม่เจริญ ถ้ายังไม่ต้องการเทอาหารลงใน petri dish ก็เก็บอาหารไว้ในขวดจนกระทั่งต้องการใช้ จึงนำขวดอาหารมาต้มในน้ำเดือดให้วุ้นละลายจนหมด แช่ขวดอาหารในอ่างน้ำควบคุมอุณหภูมิ 50-55°C จนกระทั่งอาหารมีอุณหภูมิประมาณ 50°C จึงค่อยเทลงใน petri dish และทำให้ผิวหน้าแห้งต่อไปอาหารที่ผ่านการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์แล้ว จะเก็บได้นานเป็นเดือนหรือหลายเดือนขึ้นกับชนิดของอาหาร แต่ต้องไม่เก็บนานเกินไป เนื่องจากอาหารที่เก็บนานเกินไปจะแห้ง ทำให้จุลินทรีย์ไม่สามารถเจริญได้
ความเห็น (5)
นพรัตน์ ชุ่มชื่น
เพิ่งเรียนจบ ม.6ตอนนี้อยู่ในช่วงทดลองงานค่ะ ซึ่งทำงานในห้องLabแต่ยังไม่มีความรู้และประสบการณ์ในการทำงาน อยากให้ช่วยแนะนำเกี่ยวการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อรวมถึงการปฏิบัติเครื่องมือต่างๆ และความรู้เกี่ยวกับจุลินทรีย์ให้ด้วยค่ะ ขอบคุณมากค่ะ
เป็นความรู้ที่สามารถนำไปปฏิบัติได้ดีมากๆ
- ขอบคุณค่ะ ที่นี่คนทำแบคน้อยมาก ๆ เลย ยังไงแล้วจะมาขอความรู้นะคะ
อยากทราบว่า ถ้านำอาหารเลี้ยงเชื้อหลายๆๆชนิดเข้าAutoclave พร้อมกัน จะมีผลต่อการทดสอบหาจุนทรีย์หรือไม่ อย่างไรค่ะ