How to set a new panel of fluorescent based STR-PCR ? 1: To arrange STR loci in a panel set.
หลังจากที่ลองเล่น autosomal STR ในงานการตรวจพิสูจน์พี่น้องไปได้ระยะเวลาหนึ่ง เราก็ได้ข้อสรุปว่า การใช้ autosomal STR จำนวน 15 ตำแหน่ง น่าจะไม่เพียงพอในการบอกความสัมพันธ์พี่น้องร่วมพ่อแม่เดียวกัน (full sibling) หรือแม้กระทั่งที่ ม.อ. เราตรวจเพิ่มได้อีก 9 ตำแหน่งรวมเป็น 24 ตำแหน่ง ก็ยังไม่น่าจะเพียงพอเช่นกัน
ประกอบกับชุดน้ำยาใหม่ globalfiler ของ ABI ที่จะวางตลาด ได้มีการพัฒนาเพิ่มเติมจาก identifiler ให้สามารถตรวจได้เป็น 24 ตำแหน่ง ในจำนวนนี้ เป็นตำแหน่งบน chromosome Y จำนวน 2 ตำแหน่ง เป็นตำแหน่งเดิมของ identifiler จำนวน 16 ตำแหน่ง ที่เหลืออีก 6 ตำแหน่ง เป็น autosomal STR ที่เพิ่มขึ้น แต่น้ำยา globalfiler เป็นน้ำยาที่ออกแบบมาสำหรับเครื่อง Sequencer รุ่น 3500 โดยใช้สี fluorescent ทั้งหมด 6 สี จึงทำให้เครื่องมือรุ่นเก่า อย่างเช่น 3100 หรือ 3130 หรือ 3130 xl (ผมไม่แน่ใจว่าเครื่องมือรุ่นใหญ่กว่านี้จะใช้ได้หรือไม่) ซึ่งสามารถวัดสี fluorescent ได้เพียง 5 สี ต้องทำการ upgrade เครื่องมือเสียก่อน โดยต้องเสียค่าใช้จ่ายในการ upgrade น่าจะเป็นหลักแสนบาท จึงจะทำให้เครื่องรุ่นเก่าเหล่านี้สามารถทดสอบชุดน้ำยา globalfiler ได้ครับ
ก็เลยเป็นที่มาว่า จะทำอย่างไร ให้เรา set autosomal STR ขึ้นมา ให้ครอบคลุมตำแหน่งที่มีใน globalfiler จำนวน 6 ตำแหน่ง คือ D2S441, D22S1045, SE33, D10S1248, D1S1656 และ D12S391 พร้อมกันนั้นก็เลยขอแถมเพิ่มอีก 4 ตำแหน่ง ในจำนวนนี้ มี 3 ตำแหน่งเป็น autosomal STR ที่เป็น mini STR หมายถึงเป็นตำแหน่งที่มีขนาด PCR product อยู่ในช่วง 60-120 bp ซึ่งค่อนข้างเหมาะกับการทดสอบในตัวอย่างตรวจที่มีการเสื่อมสภาพของสารพันธุกรรม และอีก 1 ตำแหน่งเป็นตำแหน่ง DYS391 ซึ่ง อยู่บนโครโมโซมวาย เอาไว้ทดสอบว่ามี Y หรือไม่ ซึ่งมีประโยชน์ในกรณีที่เป็น amelogenin Y dropout หรือใช้เป็นตัวยืนยันเพศ นอกเหนือจากการใช้ตำแหน่ง amelogenin (ตำแหน่งนี้ ก็อยู่ใน globalfiler เช่นกัน)
หลังจากที่ขีดเขียนร่างในกระดาษสักพักหนึ่ง ก็ได้ดังภาพข้างล่างนี้ครับ
โดยเป็นการเปรียบเทียบว่า ตำแหน่งที่จะ set ขึ้นเป็นตำแหน่งอะไรบ้าง มี primer กี่ set ที่ทำได้ และมี PCR product ขนาดเท่าไรบ้าง จากนั้นก็มาจัดเรียงตำแหน่งตามขนาดของ PCR product โดยแยกว่าถ้าเรา label ด้วยสี fluorescent จำนวน 4 สี จะ label ที่ตำแหน่งไหน ด้วยสีอะไร เพื่อให้สามารถแยกตำแหน่งต่างๆ ออกจากกันให้ได้ ดังภาพข้างล่างนี้ครับ
เมื่อออกแบบให้สามารถแยกตำแหน่งต่างๆออกจากกันได้แล้ว โดยการใช้สีที่แตกต่างกันดังนี้
สีน้ำเงิน label ด้วยสี FAM-6
สีเขียว label ด้วยสี VIC
สีเหลือง label ด้วยสี NED
สีแดง label ด้วยสี PET
โดยสีเดียวกัน ต้องออกแบบไม่ให้ตำแหน่งต่างๆ มีการซ้อนทับ (overlap) กันของ PCR product
จากนั้นก็กลับไปตรวจสอบว่า ตำแหน่งที่เราเลือกมานั้น ใช้ PCR primer จาก set ไหน แล้ว list primer ที่ใช้ทั้งหมดออกมาครับ ได้ดังภาพข้างล่างนี้
การที่จะ set ตำแหน่งต่างๆ เราต้องมีตัวควบคุม ที่รู้ค่าเรียบร้อยแล้ว เป็นตัวกำหนดว่า peak ที่เราจะได้จากการทดสอบของตัวอย่างนั้น ได้ peak ที่ตำแหน่งเท่าใด เพราะฉะนั้นก็ต้องไปค้นใน internet ว่าตำแหน่งที่เราจะ set ขึ้นนั้น มีตัวควบคุมตัวไหน ได้ค่า allele เท่าไหร่ ดังภาพข้างล่างนี้ครับ
พอเสร็จขั้นตอนนี้ ก็เริ่มสั่ง primer ได้ครับ ให้ label fluorescent ตามที่ต้องการ ที่เหลือก็รอเวลาที่จะได้ primer กลับมาทดสอบ......
รอ...ต่อไป....
ความเห็น (1)
.... ตามมาอ่านค่ะ ....