บทนำ
พืชวงศ์กุ่มบก (Caparadaceae) มีทั้งที่เป็นไม้ล้มลุก ไม้พุ่ม ไม้พุ่มคล้ายไม้ต้นขนาดเล็กและไม้เลื้อยมีเนื้อไม้ ใบเดี่ยวหรือใบประกอบแบบฝ่ามือที่มีใบย่อย 3 ถึง 7 ใบ มักไม่มีหูใบ ถ้ามีหูใบจะมีขนาดเล็กหรือเปลี่ยนเป็นหนาม ใบเรียงแบบสลับที่เรียงแบบเป็นคู่ตรงข้ามพบเล็กน้อย ดอกออกเป็นช่อแบบช่อเชิงหลั่น (corymb)หรือช่อกระจะ (raceme) หรือเป็นดอกเดี่ยวออกที่ปลายกิ่งหรือที่ซอกใบ มีใบประดับรองรับแต่ละดอก ส่วนมากสมบูรณ์เพศที่เป็นดอกแยกเพศพบน้อย ถ้ามีดอกแยกเพศจะแยกต้นด้วย กลีบเลี้ยงมี 4 – 8 กลีบขนาดไม่เท่ากัน บางชนิดกลีบเลี้ยงโป่งเป็นถุงและร่วงง่าย แต่ละกลีบแยกกันหรือเชื่อมกันในลักษณะต่าง ๆ กลีบดอกมี 4 – 16 กลีบ โคนกลีบคอดยาวโค้ง มักมี 2 กลีบยื่นไปข้างหลังและมีขนาดใหญ่กว่ากลีบอื่น บางชนิดไม่มีกลีบดอกเกสรเพศผู้มีตั้งแต่ 4 อันจนถึงหลายอัน แต่ส่วนใหญ่มี 6 อัน ก้านเกสรเล็กและยาว บางชนิดมีก้านชูกลุ่มเกสรเพศผู้ (androphore) และก้านนี้ต่อกับก้านชูเกสรเพศเมียด้วย (androgenophore) อับเรณูหันเข้าหาใจกลางดอก แตกตามยาว เกสรเพศเมียมีรังไข่เหนือวงกลีบ (superior ovary) มี 2 คาร์เพล (carpel) เชื่อติดกันเป็นห้องเดียวหรืออาจมีเยื่อกั้นห้องเทียมทำให้เห็นว่ารังไข่มี 2 ห้องหรือหลายห้อง ออวุลเกาะด้านหลัง ส่วนมากมีก้านชูรังไข่ (เนย้นพำ) ชัดเจน อาจสั้นหรือยาว บางชนิดไม่มีก้านชูรังไข่ ก้านเกสรเพศเมียมี 1 อัน ยอดเกสรแยกเป็น 2 พูหรือกลม ผลแห้งแตกตามตะเข็บ บางชนิดแตกแบบผักกาด (silique) บางชนิดผลมีเนื้อหลายเมล็ด (berry) รูปทรงกระบอกหรือกลม ผลเปลือกแข็งเมล็ดเดียว (nut) พบน้อย เมล็ดจำนวนมาก ขนาดเล็ก ไม่มีเอ็นโดสเปิร์ม (endosperm) เอ็มบริโอ (embryo) ใหญ่คดโค้ง ลักษณะพิเศษของดอกวงศ์นี้คือมีโครงสร้างที่บวมพองหรือเป็นแป้นหรือเป็นหลอดอยู่ด้านนอกหรือด้านในของวงศ์กลีบดอก อัจฉรา ธรรมถาวร (2540) อ้างถึงในก่องกานดา ชยามฤต กล่าวว่าสมาชิกของวงศ์นี้มีประมาณ 40 สกุล 700 ชนิด ส่วนมากพบในเขตร้อนโดยเฉพาะอัฟริกาและกึ่งร้อน เชื่อว่าวงศ์นี้มีความสัมพันธ์ใกล้ชิดกับวงศ์ Cruciferae และรายงานว่าพืชวงศ์กุ่มบกในประเทศไทยมี 5 สกุล 35 ชนิด
Thulin (1993) เสนอว่า Maerua macrocapa (จาก Somalia) น่าจะมีต้นกำเนิดมาจากพืช 3 ชนิดคือ Caparis tomentasa, M. denhardtiorum และ Thilachium thomasii หรือไม่ก็เป็นชนิดเดียวกับ M. denhardtiorum Duarte (1995) ศึกษาพืชวงศ์นี้ที่พบในเกาะ Cape Verde ประเทศโปรตุเกส พบ 45 สกุล ประมาณ 1,000 ชนิด มีการกระจายตัวเฉพาะบริเวณเขตร้อนและกึ่งร้อน โดยเฉพาะเขตอัฟริการตะวันออกและอเมริกาใต้ พืชในวงศ์นี้เป็นพืชปีเดียว พืชสองปี และหลายปีหรือเป็นไม้พุ่ม อาจเป็นไม้เลื้อยหรือไม้ต้น Rao และคณะ (1997) ศึกษา Cleome chelidonii ซึ่งเป็นพืชปีเดียว เติบโตใน Anahra Pradesh ประเทศอินเดีย ระหว่างเดือนมีนาคมถึงเดือนมิถุนายน พบว่าพืชชนิดนี้มี 3 ประเภทแตกต่างกันตามขนาดของวงศ์เกสรเพศเมีย (gynoecium) คือขนาดสั้น ปานกลาง และยาวดอกที่มีมีวงศ์เกสรเพศเมียสั้นจะไม่ติดผล ส่วนดอกที่มีวงศ์เกสรเพศเมียขนาดปานกลางและยาวเป็นดอกสมบูรณ์เพศและติดผลด้วยการผสมตัวเองและผสมข้ามดอก และ Miller (1998) พบพืชชนิดใหม่ในสกุล Crateva คือ Cr. Simplicifolia เป็นไม้พุ่ม มีความแตกต่างจากพืชชนิดอื่นคือมีใบเป็นรูปไข่กลับ ส่วนปลายใบมน มีการผลัดใบและออกดอกหลังจากที่เกิดใบใหม่แล้ว
ปัญหาเกี่ยวกับการจำแนกพืชวงศ์กุ่มบกเริ่มปรากฏเมื่อ Airy Shaw (1994-6) พบว่าพืชวงศ์ Cleomaceae มีความสัมพันธ์ใกล้ชิดกับวงศ์ย่อย Cleomaceae– วงศ์ Cruciferae แต่จริง ๆ แล้วพืชวงศ์นี้อยู่กึ่งกลางระหว่างวงศ์ Capparidaceae – วงศ์ย่อย Capparidaceae และเผ่า Cruciferae – เผ่า Stanleyeae พืชกลุ่มนี้มีกลีบเลี้ยงแผ่กว้าง เกสรเพศผู้ยื่นยาว ก้านเกสรเพศเมียยาว และกลีบดอกเป็ฯกรงเล็บที่ยาวมาก ลักษณะเหล่านี้คล้ายกับพืชวงศ์ Capparidaceae ต่อมามีการรวมพืชกลุ่มนี้ไว้ในวงศ์ Capparidaceae– เผ่า Clomeae เมื่อศึกษาพบว่าพืชวงศ์ย่อย Cleomcideae มีผลที่มีผนังกั้นเทียม จึงมีการพิจารณาลักษณะทั้งหมด แล้วแยกวงศ์ Capparidaceae ออกจากวงศ์ Cruciferae และยกสกุล Cleome ขึ้นเป็นวงศ์ Cleomaceae แต่ Watson และ Dallwitz (1991) มีความเห็นว่าการแยกสกุล Cleome ออกจากวงศ์ Capparidaceae นั้นยังมีข้อมูลสนับสนุนไม่เพียงพอ
การศึกษาครั้งนี้เป็นการศึกษาลักษณะทางกายวิภาคศาสตร์ของใบพืชวงศ์นี้ 8 ชนิด 15 ตัวอย่างในจังหวัดหนองบัวลำภู โดยศึกษาเปรียบเทียบลักษณะของใบจากพืช 4 สกุล รวมพืชสกุล Cleome ข้อมูลที่ได้จากการศึกษาลักษณะทางกายวิภาคศาสตร์ของพืชแต่ละชนิดในครั้งนี้อาจนำมาใช้ในการแก้ปัญหาในการจำแนกพืชวงศ์กุ่มบกที่กล่าวข้างต้นได้เพราะลักษณะทางกายวิภาคศาสตร์เป็นผลจากพันธุกรรม นอกจากนั้นการจำแนกพืชที่ผ่านมาพิจารณาจากลักษณะภายนอกที่มีความแตกต่างกันอย่างเห็นได้ชัดเป็นส่วนใหญ่ เช่น ลักษณะของใบ ดอก ผล เป็นต้น แต่พืชมีช่วงเวลาของการออกดอกต่างกันขึ้นอยู่กับชนิด พืชบางชนิดมีการออกดอกเพียงครั้งเดียวตลอดชั่วอายุ แต่ใบเป็นโครงสร้างของพืชที่พบตลอดชั่วอายุและมีปริมาณมาก ดังนั้นการนำลักษณะทางกายวิภาคศาสตร์ของใบมาช่วยในการจำแนกและระบุพืช (identify) จึงเป็นการแก้ปัญหาในการระบุตัวอย่างที่ไม่มีดอกได้เป็นอย่างดี นอกจากนั้นลักษณะทางกายวิภาคศาสตร์ของพืชยังสามารถใช้เป็นหลักฐานในการวิเคราะห์ชิ้นส่วนขนาดเล็กของพืชได้ เช่น ชิ้นส่วนของพืชในระบบทางเดินอาหารของสัตว์ ในผงยาสมุนไพร และในชั้นทับถมของดิน เป็นต้น
วัตถุประสงค์ของการวิจัย
1. ศึกษาลักษณะทางกายวิภาคศาสตร์ของแผ่นใบและก้านใบพืชวงศ์กุ่มบกในจังหวัดหนองบัวลำภู
2. นำข้อมูลลักษณะทางกายวิภาคศาสตร์ของแผ่นใบและก้านใบพืชวงศ์กุ่มบก มาสร้างรูปวิธานระดับสกุลและชนิด เพื่อใช้ในการจำแนกพืชที่ศึกษา
ขอบเขตของการวิจัย
ศึกษาลักษณะทางกายวิภาคศาสตร์ของแผ่นใบและก้านใบพืชวงศ์กุ่มบกในจังหวัดหนองบัวลำภู โดยการลอกผิวใบด้านบนและด้านล่าง ศึกษาลักษณะผิวเคลือบคิวทินที่ผิวใบด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบส่องกราด และการตัดตามขวางแผ่นใบและก้านใบด้วยกรรมวิธีพาราฟิน
ประโยชน์ที่คาดว่าจะได้รับ
1. ทราบลักษณะทางกายวิภาคศาสตร์ของแผ่นใบและก้านใบพืชวงศ์กุ่มบกที่ศึกษา
2. สามารถนำข้อมูลทางกายวิภาคศาสตร์ของแผ่นใบและก้านใบที่ได้จากการศึกษามาสร้างรูปวิธานจำแนกสกุลและชนิดพืชวงศ์กุ่มบกในจังหวัดหนองบัวลำภู
3. เพิ่มข้อมูลทางด้านกายวิภาคศาสตร์ของแผ่นใบและก้านใบพืชวงศ์กุ่มบกในจังหวัดหนองบัวลำภู
วิธีดำเนินการ
1. การเก็บตัวอย่างและระบุชื่อวิทยาศาสตร์
เก็บตัวอย่างพืชวงศ์กุ่มบกจากแหล่งธรรมชาติจังหวัดหนองบัวลำภู โดยกำหนดหมายเลขชิ้นตัวอย่างพรรณไม้
2. การศึกษากายวิภาคศาสตร์
2.1 การเก็บตัวอย่างดอง นำตัวอย่างใบพืชจากกิ่งเดียวกับที่เก็บเป็นตัวอย่างพรรณไม้แห้งมาล้างทำความสะอาด ทำให้เซลล์ตายและรักษาสภาพเนื้อเยื่อด้วยสารละลาย FAA 70 % (formaldehyde : acetic acid : ethylalcohol 70 % อัตราส่วน 5 : 5 : 90 โดยปริมาตร) อย่างน้อย 24 ชั่วโมง
2.2 การศึกษาลักษณะกายวิภาคศาสตร์ของผิวใบโดยการลอกผิว ล้างสารละลาย FAA ด้วยน้ำกลั่นหลาย ๆ ครั้ง ลอกผิวใบด้านที่ไม่ต้องการออกด้วยใบมีดโกนทำชิ้นตัวอย่างให้ขาวด้วยสารละลายคลอรอกซ์ 5 % ใช้เวลาตามความเหมาะสมของชิ้นตัวอย่าง แล้วล้างสารละลายออกด้วยน้ำหลาย ๆ ครั้ง นำชิ้นตัวอย่างมาย้อม (staining) ด้วยสีซาฟรานิน (safranin) 1 % ที่ละลายในน้ำ ใช้เวลาตามความเหมาะสมกับชนิดพืช ล้างสีส่วนเกินออกด้วยน้ำ ดึงน้ำออกจากตัวอย่าง (dehydration) ด้วยแอลกอฮอล์ 30 %, 50 %, 70 %, 95 %, และแอลกอฮอล์ 100 % (absolute alcohol) ผสมไซลีน (xylene) ในอัตราส่วน 1 : 1 ขั้นตอนละ 5 – 10 นาที ตามลำดับ ทำชิ้นตัวอย่างให้ใสด้วยไซลีนนาน 50 นาที ผนึกสไลด์ด้วย DPX ศึกษาสไลด์ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงและบันทึกภาพ
2.3 ศึกษากายวิภาคศาสตร์ในภาคตัดขวางของแผ่นใบ ก้านใบและก้านใบย่อยด้วยกรรมวิธีพาราฟิน ย้อมด้วยสีซาฟรานินและสีฟาสท์กรีน (fast green) (อัจฉรา, 2538)
2.3.1 การรักษาเซลล์ในตัวอย่าง นำใบพืชเพียง 1 – 3 ใบ ต่อ 1 ชนิด ตัดตามขวางเส้นกลางใบ เนื้อใบ ขอบใบ และกเนใบด้วยใบมีดโกนมาผ่านกระบวนการรักษาสภาพโดยใช้สารละลาย FAA 70 % นำไปผ่านการดูดอากาศออกจากเซลล์โดยใช้เครื่องดูดอากาศ (suction pump) แล้วแช่ใน FAA 70 % ติ่ไปอีก 24 ชั่วโมง
2.3.2 การล้างสารละลาย FAA 70 % ออกจากเซลล์เทสารละลาย FAA70 % ออกจากขวด ใส่ตัวอย่างให้มากที่สุดและรวดเร็วเพื่อไม่ให้อากาศเข้าไปในชิ้นตัวอย่าง แล้วล้างชิ้นตัวอย่างด้วยแอลกอฮอล์ 50 %
2.3.3 การดึงน้ำออกจากชิ้นตัวอย่าง ดึงน้ำออกจากตัวอย่างด้วยสารละลาย TBA (tertiary butyl alcohol) ตามลำดับความเข้มข้น (grade) จาก 1 ถึง 5 และ TBA บริสุทธิ์ ขั้นตอนละ 24 ชั่วโมงตามลำดับ
2.3.4 การนำพาราฟินเข้าสู่เซลล์ในตัวอย่าง (infitration) นำตัวอย่างไปแช่ในสารละลายที่เป็นส่วนผสมของ paraffin oil และ TBA บริสุทธิ์ อัตราส่วน 1 : 1 แล้วนำไปไว้ตู้อบที่ตั้งอุณหภูมิไว้ 60 องศาเซลเซียส ประมาณ 24 ชั่วโมง หลังจากนั้นนำตัวอย่างไปแช่ในพาราฟินบริสุทธิ์แล้วนำไปไว้ในตู้อบที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลาประมาณ 6 ชั่วโมง 3 ครั้ง ฝังชิ้นตัวพาราฟินบริสุทธิ์และปล่อยให้พาราฟินแข็งตัว แล้วนำไปติดบนแท่งไม้
2.3.5 การตัดตัวอย่าง (microtoming) นำตัวอย่างที่ติดแท่งไม้แล้วมาตัดด้วยเครื่องตัดเนื้อเยื่อแบบใช้มือหมุน ให้ชิ้นตัวอย่างมีความหนา 15 – 20 ไมโครเมตร แล้วนำไปติดบนสไลด์ที่เคลือบด้วย haupt, s adhesive โดยยึดริบบิน (ribbon) ฟอร์มัลดิไฮด์ 4 % (formaldehyde) ในน้ำ และทำให้แห้งด้วยเครื่องอุ่นสไลด์
2.3.6 การเตรียมสีย้อม (prestaining) โดยล้างพาราฟินออกจากชิ้นตัวอย่าง โดยแช่สไลด์ที่ติดชิ้นตัวอย่างไว้ในไซลีนอย่างน้อย 5 นาที แล้วนำไปแช่ในสารละลายที่เป็นส่วนผสมของไซลีนกับแอลกอฮอล์ 100 % ที่มีอัตราส่วน 1 : 1 เป็นเวลา 5 นาที แล้วแช้สไลด์ลงในสารละลายที่เป็นส่วนผสมของแอลกอฮอล์ 100 % กับอีเทอร์ (ether) อัตราส่วน 1 : 1
เป็นเวลา 5 นาที หลังจากนั้นย้ายสไลด์ไปแช่ในแอลกอฮอล์ 100 %, 95 %, และ 70 % ตามลำดับโดยแช่ไว้ขั้นตอนละ 5 นาที
2.3.7 การย้อมสี
2.3.7.1 ย้อมสีตัวอย่างด้วยสีซาฟรานิน 1 % เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ล้างสีส่วนเกินออกด้วยน้ำแล้วดึงน้ออกด้วยแอลกอฮอล์ 95 % ที่มีกรด พิคริก (picrin acid) อยู่ 0.5 % เป็นเวลา 10 นาที แช่สไลด์ตัวอย่างด้วยแอลกอฮอล์95 % อย่างน้อย 10 นาที
2.3.7.2 ย้อมสไลด์ตัวอย่างด้วยสีฟาสท์กรีน 1 % เป็นเวลาประมาณ 15 นาที ล้างสีส่วนเกินออกด้วยสารละลายที่เป็นส่วนผสมของน้ำมันกานพลู (clove oil) (น้ำมันกานพลู : แอลกอฮอล์ 100 % : ไซลีน อัตราส่วน 25 : 50 : 25 โดยปริมาตร) โดยจุ่มสไลด์ตัวอย่างลงสารละลาย 2 – 3 ครั้ง หลังจากนั้นนำไปแช่ในสารละลายที่เป็นส่วนผสมของแอลกอฮอล์ 100 % กับไซลีนอัตราส่วน 1 : 1 เป็นเวลา 5 นาที แล้วย้ายสไลด์ไปแช่ในไซลีน เป็นเวลา 5 นาที
2.3.8 ผนึกสไลด์ด้วย DePX
2.3.9 บันทึกผลการศึกษาและบันทึกภาพถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์ใช้แสง
2.4 การศึกษาลักษณะผิวเคลือบคิวทินที่ผิวใบด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด
2.4.1 ล้างตัวอย่างด้วยนำยาที่เป็นกลาง (isotonic solution) เช่นนำเกลือ (physiological saline) หรือสารละลายบัฟเฟอร์ (buffer solution) เพื่อขจัดฝุ่น หรือเมือกที่เกาะตามพื้นผิว
2.4.2 นำตัวอย่างมาเลือกและตัดด้วยใบมีดที่สะอาดและคมกริบเฉพาะส่วนที่ต้องการศึกษา
