ย้อนรอย Real-Time PCR กับบทความอมตะ
ในวารสาร Clinical Chemistry เล่มล่าสุดในหัวข้อ Citation Classic ได้นำ paper ที่ได้รับการอ้างถึงมาแล้ว 2895 ครั้งหลังจากที่ตีพิมพ์ครั้งแรก ในปี 1996 ในวารสาร Genome Research โดย Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM ซึ่งพออ่านพบแล้วก็อดไม่ได้ที่จะต้องเอาขอเอามาฝากไว้ในบล็อกนี้ด้วย เพราะ paper นี้มีชื่อว่า The Beginning of Real-Time PCR นั่นเองค่ะ
ใน paper นี้เขาเล่าถึงการที่เทคนิค PCR เริ่มโตเต็มที่จนกระทั่งมีความพยายามที่จะใช้เพื่อหาปริมาณตั้งต้นของ target แต่เนื่องจากธรรมชาติของปฏิกิริยาจะมี 3 ระยะซึ่งพอถึง plateau phase การเพิ่มจำนวนก็จะหยุดลง ทำให้ปริมาณ product คงที่ ไม่ว่าจะตั้งต้นมาจาก target เท่าไหร่ แถมยังมีปัญหาเกี่ยวกับสารที่มีผลยับยั้งปฏิกิริยา PCR ซึ่งเป็นเรื่องปกติของปฏิกิริยาที่ใช้ enzyme นั่นเอง ซึ่งก็ได้มีความพยายามที่จะใช้เทคนิค Southern และ Northern blot ที่ใช้ radioactive probe ในการที่จะวัดปริมาณ nucleic acid แต่ก็ยังคงเป็นแบบกึ่งปริมาณเท่านั้น (semiquantitative)
จากนั้นเขาก็เล่าให้ฟังถึงการค้นพบ Taqman ของ David Gelfand, Pam Holland และคณะ ทำให้เราได้รู้ว่าชื่อ Taqman นี้เขาตั้งเพื่อให้ล้อกับชื่อวิดีโอเกมรุ่นแรกๆอย่าง Pacman นั่นเอง รวมทั้งการที่ Russ Higuchi ได้ค้นพบวิธีใช้ ethidium bromide fluorescence เพื่อสังเกตปฏิกิริยา PCR ที่กำลัง run อยู่ได้ และการที่ Ken Livak และคณะค้นพบการใช้ fluorescent energy transfer ในการสร้าง signal สำหรับการทำลาย probe ด้วยคุณสมบัติของเอนไซม์ในปฏิกิริยา PCR จากนั้นก็เล่าถึงความก้าวหน้าในการพัฒนาเครื่อง PCR ซึ่งเกิดขึ้นโดย Bob Watson และทีมงานที่บริษัท Roche ที่สร้างเครื่องมือ thermo cycler ที่สามารถตรวจจับสัญญาณ EtBr fluorescence ได้แบบ real-time โดยมีอีกกลุ่มคือ Carl Witwer และ Kirk Ririe ได้พัฒนาเครื่อง thermal cycler อีกแบบที่สามารถลดเวลาในการทำ PCR ได้อีกด้วยโดยใช้วิธีที่ใช้ capillary เป็น sample container เป็นเครื่องมือต้นแบบที่คลาสสิกทีเดียว
ใน paper นี้ก็ยังเล่าถึงการใช้เทคนิคนี้ในการศึกษาเรื่อง AIDS โดย Shirley Kwok, John Sninsky และคณะที่พัฒนาวิธีวัดปริมาณ HIV viral RNA ด้วย reverse-transcription PCR ซึ่งเขาบอกว่าเป็นจุดสำคัญของการนำเทคนิคทาง PCR มาใช้ในการวินิจฉัยโรค และมีการพัฒนาเครื่องมือ Applied BioSystems เพื่อการวัดปริมาณ nucleic acid อีกด้วยมีรายละเอียดแบบย่อๆเล่าเอาไว้ด้วย
สมเป็น classic paper จริงๆแหละค่ะ สั้นๆแต่ได้ใจความ และเป็นการย้อนรอยที่มาโดยกลุ่มผู้มีส่วนในยุคต้นๆของเทคนิคพวกนี้อีกด้วยค่ะ ใครที่สามารถหาอ่านต้นฉบับได้ก็ขอแนะนำให้ลองอ่านละเอียดดูนะคะ
ใน Clinical Chemistry 55:4, 833-834 (2009)
ความเห็น (5)
สวัสดีค่ะคุณโอ๋ มีเรื่องรบกวนขอความรู้เพิ่มเติมหน่อยค่ะ คือว่าอยากทราบวิธีการวัด
8-OHdG เพื่อหาผลของการเกิดภาวะ oxidative stress น่ะค่ะ ว่ามีวิธีการวัดอย่างไร และถ้าเกิดภาวะ oxidative stress ขึ้นแล้วผล lab มันจะออกมาเป็นอย่างไรค่ะ ขอบคุณนะคะ
คุณต่ายคะ ใช้พี่ Google ช่วยเลยได้คำตอบมาเยอะนะคะ ลองค้นดูได้ค่ะ เท่าที่ดูๆจะพบว่ามี ELISA kit ขายหลายบริษัทเลยนะคะ (แต่บริษัทชื่อไม่คุ้นทั้งนั้นเลยค่ะ เมืองไทยมีไหมไม่ทราบ) เพราะฉะนั้น ELISA น่าจะเป็นวิธีที่ใช้กันมากที่สุดค่ะ
ยกตัวอย่างมาให้ตามไปอ่านสัก 2 ที่ค่ะ ที่ http://www.bioresearchonline.com/product.mvc/BIOXYTECH-8-OHdG-EIA-Kit-Quantitative-Assay-f-0001?VNETCOOKIE=NO
และ http://www.google.com/search?q=8-OHdG&hl=th&start=0&sa=N
เท่าที่อ่านพบเขาบอกว่า เจ้า 8-hydroxy-2'-deoxygaunosine นี้เป็นผลผลิตที่เกิดขึ้นระหว่างที่มีขบวนการซ่อมแซม DNA เขาจึงใช้เป็น marker สำหรับ oxidative stress กันค่ะ ยิ่งมีมากก็แปลว่าเกิดสภาวะนี้มาก พบในสภาวะ aging, cancer และ degenerative disease ต่างๆ นะคะ
สวัสดีครับ พี่โอ๋
ผมชื่อเมธี ครับ ตอนนี้เรียน ป.เอก ที่จุฬาฯ ครับ ได้ติดตามอ่านบทความของพี่โอ๋ ที่เขียนใน blog นี้ มีประโยชน์มากๆ เลยครับ ผมอยากจะปรึกษาพี่โอ๋หน่อยครับ พอดีผมกำลังเริ่มทำ real time PCR ครับ เพื่อ detect RNA virus ตัวหนึ่ง ซึ่งจะต้องมีการทำ standard curve โดย ผมทำเป็น two-step real time PCR ครับ จึงอยากปรึกษาพี่โอ๋ว่า
1. ถ้าเรามี stock virus ซึ่งทราบความเข้มข้น เช่น 6 x 10^6 PFU/ml เราสามารถสกัด RNA ทำ cDNA synthesis แล้วใช้ ความเข้มข้นของไวรัสดังกล่าวเป็นตัวเริ่มต้นในการทำ serial dilution ของ cDNA ได้เลยหรือไม่ครับ
2. ถ้าต้องมีการ clone PCR product เข้าไปใน vector ผมสามารถทำแบบวิธี cloning ปกติ จากนั้นสกัด plasmid แล้ววัด OD จากนั้นนำมาเข้าสูตรคำนวณ copies/ul แล้วนำไปทำ serial dilution วิธีการแบบนี้สามารถใช้ได้หรือไม่ครับ
ขอบคุณมากครับ พี่โอ๋
คุณเมธี May [IP: 161.200.108.156] คะ คำถามข้อแรก
1. ถ้าเรามี stock virus ซึ่งทราบความเข้มข้น เช่น 6 x 10^6 PFU/ml เราสามารถสกัด RNA ทำ cDNA synthesis แล้วใช้ ความเข้มข้นของไวรัสดังกล่าวเป็นตัวเริ่มต้นในการทำ serial dilution ของ cDNA ได้เลยหรือไม่ครับ
อันนี้ไม่แน่ใจว่าเวลาสกัด RNA จากไวรัสนั้นเราจะได้คุณภาพของ RNA ดีขนาดไหนคะ เพราะมันจะมีผลกับการสร้าง cDNA ด้วย นอกจากนั้น reverse transcriptase แต่ละตัวก็มีประสิทธิภาพในการสังเคราะห์ cDNA ต่างกันด้วย เรียกว่ามีหลายปัจจัยที่ต้องทดสอบดูก่อนน่ะค่ะ ถึงจะยืนยันได้ว่าใช้ความเข้มข้นของไวรัสเป็นตัวตั้งต้นได้ไหม น่าจะต้อง empirical (ต้องทดลองดูจริงๆ) น่ะค่ะ
ข้อ 2 อันนี้น่าจะได้ค่ะเพราะการสกัด plasmid มักจะเป็นมาตรฐาน ทำให้การวัด OD หาความเข้มข้นจะได้ผลที่เชื่อถือได้ไม่มีปัจจัยเกี่ยวกับประสิทธิภาพในการสกัดมาเกี่ยวข้อง standard จากวิธีนี้จึงน่าจะได้ค่าที่เป็นจริงถูกต้องได้
ทั้งสองคำถามตอบตามทฤษฎีที่คิดว่าใช่นะคะ แต่ก็ไม่จำเป็นต้องทดลองเองก่อนหรอกค่ะ หาดูใน paper ต่างๆก่อนดีกว่าว่า RNA virus ที่เราจะศึกษานั้นเขามีการตรวจวัดด้วยวิธีไหนได้บ้าง เราจะได้พอมี background ในการเลือกวิธีได้ง่ายขึ้น สมัยนี้ข้อมูลหาได้ง่าย ก่อนทำอะไร review ให้แน่นๆก่อนจะทำงานง่ายขึ้นค่ะ ขอให้โชคดีนะคะ (งานป.เอก บางทีก็ต้องอาศัยโชคด้วย ไม่เฉพาะความขยันอดทนอย่างเดียว)
ขอบคุณมากๆ ครับ พี่โอ๋ :)