CaseStudy22: ศพถูกเผา เอามาตรวจดีเอ็นเอได้ไหม ?

    เมื่อสองวันก่อน ผมถูกตามลงไปดูศพที่ถูกเผารายหนึ่ง สภาพตอนที่ได้รับเป็นแบบนี้ครับ

   สภาพศีรษะ และส่วนลำตัว

สภาพลำตัวส่วนล่าง 

สภาพกระดูกสันหลัง และ ซึ่โครง

สภาพด้านหลังครับ ถูกไหม้ไฟดำ เหมือนกัน

     คำถาม ก็คือ ศพนี้เป็นเพศชาย หรือเพศหญิง และ พอจะเก็บตัวอย่างสำหรับตรวจดีเอ็นเอได้ไหม ถ้าได้ ควรเก็บจากตัวอย่างตรวจไหน

สำหรับคำถามแรกคือ ศพนี้เป็นเพศชาย หรือ หญิงนั้น อาจารย์สุวิทย์ ดูจากสภาพภายนอกแล้ว ตอบไม่ได้ครับว่าเป็นเพศชาย หรือเพศหญิง และไม่พบกระดูกบริเวณหัวเหน่า ที่ใช้ระบุเพศได้ ดังนั้น จึงต้องดูจากกระโหลกศีรษะ ซึ่งสภาพถูกไฟไหม้ค่อนข้างมาก เมื่อเลาะเอาเศษรอยไหม้บริเวณโหนกคิ้ว เพื่อดูรอยนูนของกระดูกบริเวณนั้น เศษกระดูกก็หลุดออกมา ทำให้ไม่สามารถระบุเพศได้ครับ

     แม้ศพจะถูกเผาเป็นตอตะโก แต่ยังมีบางส่วนที่ไหม้ไฟน้อยหน่อย สันนิษฐานว่า น่าจะเป็นการเผาในท่านอน แล้วเป็นการนอนตะแครงข้าง ด้านที่อยู่ติดพื้นจึงถูกเผาน้อยกว่า

     อาจารย์สุวิทย์ จึงเริ่มเลาะผิวหนัง บริเวณที่ถูกไฟไหม้น้อยๆ นั้นครับ มองเห็นกล้ามเนื้อที่ถูกไฟไหม้สุก และเห็นกระดูกอ่อน ในสภาพที่ยังขาวอยู่ แต่ส่วนด้านในที่ติดกับปอดนั้น อยู่ในสภาพถูกไฟไหม้ดำหมดครับ

     ความหวังเดียว ที่อาจจะเก็บตัวอย่างดีเอ็นเอของศพนิรนามรายนี้ได้ ก็น่าจะมาจากกระดูกอ่อนบริเวณนี้แหละครับ อาจารย์สุวิทย์จึงใช้ใบมีดกรีดเก็บท่อนกระดูกอ่อน (cartilage) บริเวณซี่โครง จำนวน 2 ชิ้นครับ

    สภาพกระดูกอ่อน ที่ตัดมาเพื่อส่งตรวจหารูปแบบดีเอ็นเอ

     และเพื่อความไม่ประมาท ก็เลยตัดซึ่โครงบริเวณนั้นส่งมาด้วยครับ

     สภาพซี่โครง ที่ตัดออกมาครับ

     จากกระดูกอ่อนที่ได้ จึงนำมาตัดเป็นชิ้นเล็กๆ ใส่ใน eppendorf tube ล้างด้วยน้ำกลั่นหลายๆรอบ จากนั้นจึงตัดกระดูกอ่อนเป็นชิ้นเล็กๆ ด้วยกรรไกร ตามวิธีการที่เคยเล่าให้ฟังแล้วครับ  แล้วเติม 5% chelex resin และ proteinase K ลงไป เพื่อย่อยกระดูกอ่อนข้ามคืนครับ

     สภาพของกระดูกอ่อน หลังจากย่อยข้ามคืนเสร็จแล้ว จึงนำมาต้มที่ 100 C เป็นเวลา 15 นาที นำไปวัดปริมาณดีเอ็นเอด้วยวิธี spectrophotometer ปรากฎว่า ไม่สามารถวัดปริมาณดีเอ็นเอได้ครับ เนื่องจากมีปริมาณดีเอ็นเอสูงเกินไป (ในที่นี้ผมเจือจางด้วยน้ำกลั่น 10 เท่า) ที่ความยาวคลื่น 260, 280, 320 และ 230  nm มีค่า OD มากกว่า 2.5 ทั้งหมดครับ ซึ่งแสดงว่า เราไม่สามารถเชื่อถือค่าเหล่านี้ได้เลย เพราะฉะนั้นการเจือจางดีเอ็นเอ เพื่อนำไปเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในหลอดทดลองนั้น จึงต้องประมาณค่าเองครับ  (ในบางตัวอย่างตรวจอาจวัดปริมาณดีเอ็นเอได้ครับ เช่น 400 ug/ul เป็นต้น ส่วนใหญ่มักให้ค่าปริมาณดีเอ็นเอค่อนข้างสูงครับ แต่ผมจะดูค่า 260/230 ratio ถ้ามีค่าสูง อย่างเช่นรายนี้ คำนวณ ratio 260/230 ไม่ได้ เนื่องจากค่า OD ที่ 230 มีค่าสูงกว่า 2.5 นั่นหมายความว่า เราเชื่อถือค่าปริมาณดีเอ็นเอในตัวอย่างตรวจรายนั้นไม่ได้ และบ่อยครั้ง มักพบว่ามันมี PCR inhibitor ในตัวอย่างตรวจประเภทนี้ค่อนข้างสูงครับ ดังนั้นการเจือจางตัวอย่างตรวจจำพวกนี้ จึงต้องใช้ประสบการณ์ และทักษะความชำนาญเฉพาะตัวครับ  แต่สำหรับท่านที่มีเครื่องวัดปริมาณดีเอ็นเอ ด้วยวิธี real time PCR ปัญหานี้คงหมดไปครับ)

  ดังนั้น รายนี้ จึงเจือจางตัวอย่างตรวจ 3, 5, 10 และ 20 เท่า ครับ  แล้วนำไปเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยใช้ชุดน้ำยา Identifiler Plus สำหรับตรวจ autosomal STR จำนวน 15 ตำแหน่งครับ โดยใช้ Master Mix 2  ul, Primer 1  ul  และ PSU Enhancer อีก 1 ul จากนั้น เติมดีเอ็นเอที่เจือจางแล้ว 2  ul แล้วนำไปเข้าเครื่องทำ PCR จำนวน 28 รอบครับ

     เจ้าน้ำยา PSU Enhancer เป็นน้ำยาที่เราพัฒนาขึ้นเองครับ มีคุณสมบัติในการยับยั้งการออกฤทธิ์ของ PCR inhibitor ลดการเกิด non specific และ ช่วยเพิ่มให้การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอให้เกิดได้ดียี่งขึ้นครับ

     จากนั้น จึงนำมาเข้าเครื่องอ่าน fragment analysis ได้ผลดังภาพครับ  พบว่าทุกตัวอย่างตรวจ ได้ผล autosomal STR ครบทั้ง 15 ตำแหน่งครับ และถ้ายิ่งเจือจางมากขึ้น เช่น 1:10 หรือ  1:20 จะยิ่งมี ความสูงของ peak สูงยิ่งขึ้นครับ นั่นแสดงว่า ในตัวอย่างของเรามี  PCR inhibitor อยู่ครับ  แต่ที่เราสามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้อยู่นั้น อาจเป็นเพราะ

     1. ปริมาณ PCR inhibitor ที่มีอยู่อาจมีปริมาณไม่สูงมากเพียงพอ ที่จะยับยั้งการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในหลอดทดลอง ดังนั้นการเจือจางเพียงแค่ 3 เท่า หรือ  5 เท่า ก็สามารถเจือจาง inhibitor นี้จนไม่สามารถยับยั้งการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในหลอดทดลองได้แล้ว

     2. แม้ว่าในตัวอย่างของเรา อาจมี PCR inhibitor อยู่ แต่ในการทดสอบนี้ เราใส่น้ำยาเทวดา PSU enhancer ซึ่งมีคุณสมบัติในการยับยั้งการออกฤทธิ์ของ PCR inhibitor และช่วย promote การทำ PCR ทำให้สามารถเพิ่มปริมาณ PCR ได้ดียิ่งขึ้นกว่าปกติ ลงไปด้วย น้ำยา PSU Enhancer จึงช่วยให้เราสามารถได้ผลรูปแบบดีเอ็นเอออกมาได้ แม้ในสภาพที่มี PCR inhibitor อยู่ในตัวอย่างตรวจก็ตามครับ

    สำหรับรายนี้ จึงตอบคำถามข้อแรกได้แล้วครับว่า ศพที่ถูกไฟไหม้นี้เป็นเพศชาย เก็บรูปแบบดีเอ็นเอได้ครบทั้ง   15 ตำแหน่งครับ  นั่นหมายความว่า หากมีคู่เทียบที่เหมาะสม เราสามารถทราบได้ครับว่า ศพนี้เป็นใคร และมีโอกาสที่จะส่งเขากลับบ้านได้อย่างถูกต้องแล้วครับ

     ดูจากสภาพของศพแล้ว ดูเหมือนไม่น่าจะตรวจรูปแบบดีเอ็นเอได้เลยครับ แต่จากประสบการณ์ของอาจารย์สุวิทย์ การเก็บ Cartilage หรือกระดูกอ่อน เป็นทางเลือกหนึ่งที่น่าสนใจ โดยเฉพาะในรายที่ถูกไฟไหม หรือศพเน่า ครับ

[ขจิต ฝอยทอง]

พี่ Mitoครับ

กว่าจะตรวจได้ว่าเป็นผู้หญิงหรือผู้ชาย

ไม่ง่ายเลยครับ ใช้ความวิริยะ อุสาหะมากๆ

รออ่านต่อครับ