การเตรียมตัวอย่าง สำหรับสกัดดีเอ็นเอจากชิ้นเนื้อแช่ฟอร์มาลินด้วยวิธี chelex
เริ่มต้นผมคงต้องบอกไว้ก่อนครับ ว่าชิ้นเนื้อแช่ฟอร์มาลินไม่ใช่ตัวอย่างที่เหมาะสำหรับการสกัดดีเอ็นเอเพื่อนำมาใช้ในการตรวจพิสูจน์ดีเอ็นเอครับ เพราะการเอาชิ้นเนื้อไปแช่ฟอร์มาลิน มันจะทำให้เจ้าฟอร์มาลินค่อยๆแทรกเข้าไปจับกับสายดีเอ็นเอครับ เป็นลักษณะของการ crosslink ของสายดีเอ็นเอกับฟอร์มาลิน ยิ่งแช่ไว้นาน ก็จะเกิดการ crosslink กันมากขึ้น และเกิดการขาดเป็นสายสั้นๆ (DNA fragmentation) แล้วดีเอ็นเอแบบที่ขาดเป็นสายสั้นๆนั้น เมื่อนำมาเพิ่มปริมาณด้วยวิธี PCR ก็อาจตรวจได้เฉพาะตำแหน่งที่มี PCR product ไม่ยาวมากครับ ทำให้ตรวจได้ไม่ครบทั้ง 15 ตำแหน่ง เมื่อตรวจด้วยน้ำยาสำเร็จรูป ส่วนเจ้าดีเอ็นเอที่จับกับฟอร์มาลิน (modified DNA) หากปรับเปลี่ยนโดยการไล่ฟอร์มาลินออกไปไม่หมด เจ้าดีเอ็นเอประเภทนี้ ก็อาจนำไปเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยวิธี PCR ได้ไม่ดี หรือไม่ได้เลยครับ
เราจะไล่เจ้าฟอร์มาลินออกจากดีเอ็นเอได้อย่างไร ?
โดยทั่วไปนิยมใช้วิธีการให้ความร้อนครับ อาจจะใช้อุณหภูมิ 90 องศาเซลเซียส นาน 1 ชั่วโมง การใช้อุณหภูมิสูงกว่านี้ หรือ เวลานานกว่านี้ อาจมีผลให้เกิด DNA fragmentation มากขึ้น (Ref: QIAamp DNA FFPE Tissue Handbook, Oct 2007 หน้า 15)
ชิ้นเนื้อแช่ฟอร์มาลินไว้ได้นานแค่ไหน ถึงยังตรวจดีเอ็นเอได้ครบ profile ?
เรื่องนี้ จินตนา ได้ทำการศึกษาเบื้องต้นไว้ โดยเอาชิ้นเนื้อมาแช่ฟอร์มาลินไว้ แล้วตัดชิ้นเนื้อเล็กๆ ออกมาตรวจดีเอ็นเอวันละชิ้น ลองดูว่า กี่วัน มันถึงจะเริ่มตรวจได้ไม่ครบ 15 ตำแหน่ง แล้วเป็นเพียงการทดลองทำเพียงเนื้อชิ้นเดียวครับ การสรุปผลจากการทดสอบเพียงเท่านี้คงไม่ได้ชัดเจนครับ เพียงแต่บอกได้คร่าวๆว่า ชิ้นเนื้อที่แช่ฟอร์มาลินไว้ 1 อาทิตย์สามารถนำมาสกัดดีเอ็นเอ แล้วตรวจรูปแบบดีเอ็นเอได้ครบ 15 ตำแหน่ง แต่ถ้าแช่ไว้นานกว่า 1 อาทิตย์ เป็นไปได้มากครับที่อาจจะตรวจดีเอ็นเอได้ไม่ครบทั้ง 15 ตำแหน่ง
มาคราวนี้ ผมได้รับชิ้นเนื้อที่แช่ฟอร์มาลินไว้ 3 เดือน.....ตอบได้เลยครับว่าโหด....มาก โอกาสที่จะได้ดีเอ็นเอครบทั้ง 15 ตำแหน่ง เป็นเรื่องยาก...ครับ
ชิ้นเนื้อนี้ ผมนำมาสกัดดีเอ็นเอ ด้วยวิธี Qiagen ผล คือไม่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้ ลองสกัดด้วยวิธี sodium iodide ก็ให้ผลไม่ต่างกัน สุดท้ายก็ต้องกลับมาลองวิธีดั้งเดิม อย่าง Chelex แล้วปรากฎว่าสามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้เพียง 1 ตำแหน่ง คือตำแหน่ง Amelogenin ส่วนตำแหน่งอื่นๆ ไม่ขึ้นครับ case นี้สุดท้ายก็ต้องใช้การตรวจไมโตคอนเดรีย ในการพิสูจน์ครับ ซึ่งดีเอ็นเอจากการสกัดด้วย chelex ให้ผลการตรวจที่ชัดเจนมาก ขณะที่ดีเอ็นเอที่สกัดจากวิธีอื่น ขึ้น band จางๆ หรือไม่ขึ้นเลยครับ
มาดูวิธีการเตรียมชิ้นเนื้อ เพื่อใช้ในการสกัดดีเอ็นเอด้วยวิธี chelex ครับ
1. เริ่มจากนำชิ้นเนื้อแช่ฟอร์มาลินออกมาวางบนสไลด์สะอาดครับ
2. ใช้ใบมีด ตัดชิ้นเนื้อ ให้มีขนาดตามต้องการ ในที่นี้ผมฝานให้ได้ความหนาประมาณ 1-2 มิลลิเมตร กว้างประมาณ 3-5 มิลลิเมตร ยาวประมาณ 5-8 มิลลิเมตร
3. จากนั้นใช้กระดาษ tissue พับซ้อนกันหลายชั้น วางทับบนชิ้นเนื้อ แล้วใช้ใบมีดวางทับบนกระดาษ tissue อีกชั้นหนึ่ง แล้วออกแรงกดบี้ชิ้นเนื้อให้แบน ขั้นตอนนี้ มีวัตถุประสงค์ในการกดทับชิ้นเนื้อ เพื่อบีบเอาฟอร์มาลินออกจากชิ้นเนื้อให้มากที่สุด
4. ชิ้นเนื้อหลังจากกดทับแล้ว จะอยู่ในสภาพที่แห้ง และแบน ดังภาพ
5. นำชิ้นเนื้อใส่ในหลอด eppendorf ขนาด 1.5 มิลลิลิตร จากนั้นสับชิ้นเนื้อให้ละเอียด โดยใช้กรรไกร ตามวิธีที่อธิบายในบันทึกนี้ครับ แล้วนำไปปั่นล้างให้สะอาดด้วยน้ำกลั่นที่ความเร็ว 8,000 รอบต่อนาที นาน 1 นาที สัก 2 ครั้ง จากนั้นจึงเติม 5% chelex 100 ลงไปสัก 100-200 ไมโครลิตร และเติม 20 ug/ml proteinase K 20 ไมโครลิตร อุ่นไว้ที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส นาน 30-60 นาที แล้วนำไปต้มที่ 100 องศาเซลเซียส นาน 12 นาทีครับ อ่านเพิ่มเติมวิธีการสกัดดีเอ็นเอด้วยวิธี Chelex ที่นี่ครับ
ความเห็น (2)
ขั้นตอนที่กดทับเอา formalin ออกดูน่าหวาดเสียวคมใบมีดจังค่ะ เดี๋ยวมันดีดโดนมือ ใช้อุปกรณ์อื่นที่ไม่น่าจะเป็นอันตรายน่าจะได้ไหมคะ
เป็นการบรรยายขั้นตอนที่ชัดเจนยอดเยี่ยมมากค่ะ ทุกขั้นตอนเลย
พี่โอ๋
เอาอะไรแข็งๆ กดทับไว้ก็ได้ครับ เพราะเพียงแค่กดทับเพื่อไล่ฟอร์มาลินออกให้มากที่สุดครับ ที่ผมใช้ใบมีดก็เพราะว่าขั้นตอนก่อนหน้านี้ ต้องใช้ใบมีดตัดชิ้นเนื้อให้ได้ขนาดที่ต้องการ ก็เลยมีใบมีดอยู่ในมือพอดี เลยใช้ของที่อยู่ในมือให้เป็นประโยชน์ก่อนจะทิ้งไป....อิ อิ
ขอบคุณมากครับ พี่โอ๋