คู่มือการทดสอบ Special Tests : 17-KS

การตรวจ 17 – Ketosteroid (17- KS ) แพทย์มักส่งตรวจไม่บ่อยนัก วิธีการก็ยุ่งยาก ซับซ้อนพอสมควร ใช้เวลาประมาณค่อนวัน แต่ก็ยังน้อยกว่า 17-KGS

ความสำคัญ

        17 – Ketosteroid (17- KS) หมายถึง metabolites ของแอนโดรเจน (androgens) ซึ่งมี  ketone group ที่คาร์บอนตำแหน่ง 17 ได้แก่ Dehydroepinandrosterone (DHEA), Androsterone, Etiocholanolone สารเหล่านี้ถูกขับออกในปัสสาวะ ในรูป conjugated  กับ sulfate เป็นส่วนใหญ่ และส่วนน้อยกับ glucuronic acid  วิธีการตรวจหาระดับของ 17 – KS ในปัสสาวะ โดยทั่วไปมีขั้นตอนดังนี้ คือ Hydrolysis, Extraction, Purification และ Colorimetric reaction  

หลักการ

          17 – Ketosteroid ที่ถูกขับออกทางปัสสาวะในรูป conjugated กับกรด glucuronic และ sulfuric จะถูก hydrolysis ให้อยู่ในรูปอิสระ แล้วสกัดด้วย dichloromethane m – dinitrobenzene จะให้สารประกอบสีชมพู 17 – KS ซึ่งมีค่าการดูดกลืนแสงสูงสุดที่ 520 nm  ปฏิกิริยานี้เรียกวา Zimmermann reaction 

สิ่งส่งตรวจ : ปัสสาวะ 24 hr. ใช้กรด HCl เป็นสาร preservative

น้ำยา

1. Sodium hydroxide 50 % (W/V) : ละลาย Sodium hydroxide 50 gm ด้วยน้ำกลั่น แล้วปรับปริมาตรให้ครบ 100 ml เก็บสารละลายในขวดพลาสติก
2. Hyamine 1622 solution 2.5 % : ละลาย Hyamine 1622 25 gm ด้วยน้ำกลั่นแล้วปรับปริมาตรให้ครบ 1 ลิตร
3. Meta – dinitrobenzene solution : ละลาย Meta – dinitrobenzene บริสุทธิ์ 0.18 gm  ( เก็บที่อุณหภูมิห้อง ) ด้วย Hyamine 1622 solution 2.5 % ให้ได้ 100 ml แล้วเก็บที่อุณหภูมิ 4 ⁰C สารละลายนี้มีอายุ 1 เดือน
4. Potassium hydroxide 10 N : ละลาย Potassium hydroxide 280 gm ด้วยน้ำกลั่นแล้วปรับปริมาตรให้ครบ 500 ml แล้วเก็บสารละลายในขวดพลาสติก
5. Formalin solution 10 % : ละลาย Formalin 10 ml ด้วยน้ำกลั่นแล้วปรับปริมาตรให้ครบ 100 ml
6. Dichloromethane หรือ Methylene chloride
7.Hydrchloric acid , concentrated
8.Stock standard solution 1 mg/ml : ละลาย dihydroepiandrosterone 100 mg ด้วย methanol แล้วปรับปริมาตรให้ครบ 100 ml เก็บที่อุณหภูมิ 4 ⁰C9.
  Working standard solution 0.04 mg/ml : เจือจาง Stock standard solution 1 ml ด้วย methanol 25 ml แล้วเก็บที่อุณหภูมิ 4 ⁰C

วิธีทำ

1.     เตรียมหลอดฝาเกลียวขนาด 25 X 150 mm สำหรับสกัดแยก 17- KS อิสระออกจากปัสสาวะ แล้วเติมสารดังนี้ ปัสสาวะ 5.0 ml ,Formalin solution 0.1 ml และ conc HCl 0.5 ml
2.     เขย่าอย่างแรง แล้วต้มในน้ำเดือดนาน 15 นาที
3.     ทำให้เย็นโดยให้น้ำก๊อกไหลผ่าน
4.     เติม Dichloromethane 20 ml เขย่านาน 20 นาที
5.     ปั่นแยก 2 นาที ดูดชั้นปัสสาวะทิ้ง (ชั้นบน)
6.     เติม 50 % Sodium hydroxide  10 ml เขย่า 2 นาที แล้วปั่นแยก 2 นาที
7.     ดูดชั้น Dichloromethane (ชั้นบน) 5 ml ใส่หลอดฝาเกลียวขนาด 16 X 125 mm แล้วนำไปทำให้แห้งที่ 60 ⁰C (หลอดนี้ใช้ทำเป็น unkmown)
8.     เตรียมหลอดฝาเกลียวขนาด 16 X 125 mm สำหรับทำเป็น Blank และ Standard แล้วทำตามตาราง

	Blank (ml)	Standard(ml)	unkmown(ml)
Methanol	0.5	-	0.5
Working standard	-	0.5	-
Meta – dinitrobenzene solution	0.2	0.2	0.2
10 N KOH	1.0	1.0	1.0

          ผสมให้เช้ากัน แล้วตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องนาน 10 นาที

2.5 % Hyamine 1622 solution

1.0

1.0

1.0

ผสมให้เข้ากัน แล้วนำไปอ่าน absorbance ที่ 525 nm โดยใช้ Blank set  ศูนย์

การคำนวณ

    17 – KS (mg/day) = Au X 16  X Volume of urine24 hr
                                  As                   1000 

ค่าปกติ

          ผู้ชาย  10 – 25 mg/day         
          ผู้หญิง 5 –15 mg/day           
          สตรีวัยหมดระดู 2 –10 mg/day           
          เด็กน้อยกว่าอายุ 1 ปี  < 1 mg/day           
          เด็กอายุ 1 – 4 ปี  < 2 mg/day                      
                     5- 8 ปี  < 3 mg/day                  
                     8–12 ปี   3 – 10  mg/day      
                    13 –16ปี  5 – 12  mg/day

ข้อสังเกต

1.     17 – Ketosteroids หรือบางครั้งเรียก 17 – oxosteroids นี้ได้แก่ Androsterone, Epiandrosterone, Dehydroepiandrosterone, Etiocholanolone, 11 – keto - androsterone, 11 – keto - etiocholanolone, 11 – hydroxy - androsterone, 11 – hydroxy – etiocholanolone ซึ่งจะพบได้ในรูป conjugated กับ glucoronic acid และ sulfuric acid ในผู้ชายประมาณ 2/3 ของ 17 – KS ในปัสสาวะมาจาก adrenal gland ที่เหลือมาจาก testis ในผู้หญิงเกือบทั้งหมดมาจาก adrenal gland
2.     วิธีนี้ฮอร์โมนถูกสกัดจากปัสสาวะ 5 ml ไปละลายอยู่ใน 20 ml dichloromethane แต่ใช้ dichloromethane เพียง 5 ml ในการตรวจวัดขั้นต่อไป ดังนั้นปริมาณฮอร์โมนในปฏิกิริยาสุดท้ายจึงมาจากปัสสาวะ  1.25 ml (5/20 X 5 = 1.25 )
3.     ทุกขั้นตอนที่ใช้ dichloromethane ควรทำในตู้ดูดควัน เพราะเป็นพิษ ถ้าสูดเข้าทางลมหายใจ
4.     Hyamine 1622 ซึ่งเป็น detergent ตัวหนึ่ง ใช้สำหรับละลาย meta – dinitrobenzene  และ ผลิตผลจากปฏิกิริยา
5.     น้ำและสารบางชนิดเช่น estrogen จะถูกสกัดด้วย dichloromethane  ด้วย แต่จะถูกกำจัดออกด้วย sodium hydroxide
6.     ระหว่างการทำให้เกิดสี ต้องปิดหลอดด้วยพาราฟิล์ม หรือจุกคอร์ก เพื่อป้องกันสารละลายที่เป็นด่างเข้มข้นไม่ให้ดูดน้ำจากอากาศ ซึ่งจะมีผลทำให้สีที่เกิดลดลง และเนื่องจาก Zimmermann reaction มีคุณสมบัติไวต่อแสง (photosensitive) จึงต้องเก็บหลอดต่าง ๆ ไว้ในที่มืด

เอกสารอ้างอิง

Anni. J.S. and Giese, R.W. Clinical chemistry : Principles and procedure., 4 ^th-ed. Little, Brown and company, Boston, 1976