seqeunce ไม่สวย แก้ยังไงดี

     วันก่อน มีนักศึกษาปริญญาโท นำภาพลำดับเบสของดีเอ็นเอ (sequence) มาให้ดู ภาพนี้มีลักษณะของ peak แบ่งเป็น 2 กลุ่ม กลุ่มแรก peak ค่อนข้างสูง (major peak) กับกลุ่มที่สอง peak เตี้ยกว่า (minor peak) โดย peak ทั้งสองกลุ่มซ้อนทับกัน หรือที่เรียกว่า เป็น peak under peak คำถามคือ เกิดอะไรขึ้น แล้วจะแก้ไขปัญหานี้ได้อย่างไร

     ก่อนที่จะไปถึงตรงนั้น เพื่อให้เราทำความเข้าใจได้ดียิ่งขึ้น เราลองมาดูลักษณะของลำดับเบสที่ดีก่อนนะครับว่ามันมีลักษณะเป็นอย่างไร sequence ที่ดี ต้องมีลักษณะ peak ที่สูง ขึ้นสุด ลงสุด ไม่มีการซ้อนทับกัน ไม่มี peak under peak อย่างภาพข้างล่างนี้ครับ

     เมื่อเห็นความแตกต่างของ sequence ที่ไม่สวย กับ sequence ที่สวยแล้ว ทีนี้ลองมาวิเคราะห์กันดูนะครับ ว่า เกิดอะไรขึ้นทำไมจึงได้ภาพ peak under peak 

     ลักษณะของ peak under peak เกิดขึ้นได้จากสองสาเหตุใหญ่ๆ ครับ ได้แก่

1. มี template มากกว่า 1 เส้น (multiple templates) ในที่นี้คือมี DNA เป็น 2 กลุ่ม กลุ่มหนึ่งมีปริมาณมากกว่า ก็ให้ peak สูงกว่า เป็น major peak กับอีกกลุ่มมีปริมาณน้อยกว่า ก็ให้ peak ต่ำกว่า เป็น minor  peak  แล้วเราจะรู้ได้อย่างไรว่า มันมี template มากกว่า 1 เส้น อันนี้ก็ต้องกลับไปดู ภาพ electrophoresis ของ PCR product ครับว่าตอนที่ run gel นั้น ตัวอย่างนี้ ให้ band กี่ band หากปัญหาเกิดจากสาเหตุนี้ ภาพที่ได้ควรต้องมี band มากกว่า 1 band หรือ มี smear เกิดขึ้นครับ แล้วจะแก้ไขปัญหาอย่างไร การแก้ไขปัญหา ก็ต้องใช้วิธีการตัดเจล โดยเลือกตัดเจลเฉพาะตำแหน่งที่ให้ PCR product ขนาดที่เราต้องการเท่านั้น แล้วมาสกัดดีเอ็นเอจากเจล จากนั้นก็นำไปทำ sequence ใหม่ครับ หากเจลที่เราตัดนั้นไม่มีการปนเปื้อน template ตัวอื่นเข้ามา การทำ sequence ใหม่ ก็น่าจะให้ลักษณะ peak ที่สวยเหมือนภาพที่สองที่แสดงครับ แต่หากยังมีการปนเปื้อน template ตัวอื่นอยู่ การทำ sequence ใหม่ ก็จะยังให้ภาพ peak under peak อยู่ครับ โดยประเมินการปนเปื้อนได้จาก ความสูงของ peak ทั้งสอง แล้วคำนวณเป็นร้อยละครับ ถ้าไม่อยากตัดเจล ก็มีอีกวิธีหนึ่ง คือต้องกลับไปปรับ parameter ทั้งในส่วนของ magnesium ion และ/หรือ annealing temperature จนกระทั่ง การทำ PCR ได้ PCR product เพียง band เดียว และเป็น band ที่มีขนาดของ PCR product เท่ากับที่เราต้องการครับ แล้วจึงค่อยนำมา sequence ใหม่
2. มันมี template เพียงแค่ 1 เส้นครับ โดยยืนยันกับ gel electrophoresis ภาพที่ได้ มีเพียง band เดียวชัดเจน ไม่มี smear ไม่มี band อื่นให้ปวดหัวใจเล่น ถ้าแน่ใจอย่างนี้แล้ว ปัญหาที่อาจเกิดขึ้นแล้วทำให้ได้ภาพ sequence แบบนี้ ที่เป็นไปได้อีกอย่าง คือ ขั้นตอนการทำความสะอาด PCR product (cleaning) ขั้นตอนนี้ มีหลายวิธีการให้เลือกทำครับ แต่ไม่ว่าจะใช้การทำความสะอาดด้วยวิธีใดก็ตาม สุดท้ายคือ กำจัด primer ออกไม่หมดครับ ยังคงเหลือ primer ไว้ส่วนหนึ่ง ซึ่ง primer ที่เหลือไว้ มันจะมี ทั้ง forward primer และ reverse primer ทำให้เมื่อมาทำ sequence แล้วใส่ primer เข้าไปข้างเดียว แต่มี primer อีกข้างที่เหลืออยู่ในปฏิกิริยาเนื่องจาก กำจัดมันออกไปไม่หมด primer ที่เหลืออยู่นี้จะเป็นคนละข้างกันกับตัวที่เราใส่เข้าไป และมีปริมาณน้อยกว่า เมื่อทำปฏิกิริยา sequencing ทำให้ primer เส้นที่เราใส่เข้าไป ให้ผลเป็น major peak ขณะที่ primer ข้างที่กำจัดออกไม่หมด ให้ผลเป็น minor peak วิธีการแก้ไขปัญหานี้ คือต้องกลับไปเริ่มที่ขั้นตอนการทำความสะอาด PCR product สำหรับที่ห้องแล็บที่นี่ ผมใช้วิธี ExoSAP ในการทำความสะอาด PCR product โดยเจ้าตัว Exonuclease (Exo) จะเป็นตัวที่ใช้ทำลาย primer ส่วนตัว shrimp alkaline phosphatase (SAP) จะเป็นตัวที่ใช้ทำลาย dNTP นั่นหมายความว่า ในตัวอย่างนี้ อาจมี PCR product มากเกินไปจนเจ้า Exonuclease กำจัด primer ออกไปไม่หมด หรือ อาจเกิดจากมี PCR product เหมาะสมแล้ว แต่เจ้า Exonuclease อาจใส่ลงไปน้อยเกิน หรือเจ้านี่อาจจะเริ่มเสื่อมสภาพบางส่วน จึงทำให้ทำลาย primer ออกไปไม่หมดครับ ไม่ว่าจะเกิดจากสาเหตุใดก็ตาม แต่สุดท้ายก็คือ มี primer บางส่วนหลงเหลืออยู่ในปฏิกิริยาครับ ทำให้เกิดอาการอย่างที่ว่านี่  การแก้ไข คือ ให้เพิ่มปริมาณ Exonuclease ลงไปในปฏิกิริยาครับ เมื่อกำจัด primer ส่วนเกินได้หมด อาการนี้ก็จะหายไปครับ หรือหากทำความสะอาดด้วยวิธีอื่นๆ ก็ลองกลับไปทำความสะอาดใหม่ครับ เอาให้แน่ใจว่ากำจัด primer ออกไปได้หมดเป็นใช้ได้ครับ