ทำไงดี เมื่อ Taq polymerase เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอไม่ได้

     จากการเปรียบเทียบผลการตรวจลายพิมพ์ดีเอ็นเอ ระหว่างห้องปฏิบัติการ ประจำปี 2554 ซึ่งทางสถาบันนิติวิทยาศาสตร์ กระทรวงยุติธรรมเป็นเจ้าภาพ จำนวน 5 ตัวอย่าง ให้ทำการทดสอบเท่าที่สามารถทำได้ ได้แก่ พ่อ-แม่-ลูก และ Mixed profile 1 เปรียบเทียบกับผู้ต้องสงสัย

     ในจำนวนตัวอย่างตรวจเหล่านี้ มีสองตัวอย่างคือ PAR2011-02 ซึ่งเป็นตัวอย่างของแม่ และ PAR2011-03 เป็นตัวอย่างของลูก ที่ต้องตรวจเปรียบเทียบไมโตคอนเดรีย ว่ามีความสัมพันธ์ญาติทางสายแม่ (แม่-ลูก) สองตัวอย่างนี้ ผมใช้เวลานานมากในการทำการทดสอบ เนื่องจากไม่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยวิธี polymerase chain reaction ได้ 

     ตัวอย่างตรวจที่ได้นี้เป็นหยดเลือด ที่เก็บบน FTA paper ทีนี้เจ้า FTA paper มันมีน้ำยา commercial สำหรับสกัดขายอยู่ แต่ห้องแล็บผมไม่ได้ใช้ชุดน้ำยานี้เป็นงานประจำ ดังนั้นก็เลยต้อง modify ครับ เพื่อให้สามารถสกัดดีเอ็นเอออกมาทำการทดสอบให้ได้ เริ่มจาก

     วิธีที่ 1 ตัดกระดาษ FTA ออกมา นำมา Fix ด้วย Methanol  แล้ว Elute ดีเอ็นเอออกมาด้วยน้ำกลั่น 

              ผลการทดสอบ......ดีเอ็นเอที่สกัดได้มีปริมาณน้อยเกินไป (low copy number) สำหรับทดสอบ autosomal STR และไม่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอสำหรับตรวจไมโตคอนเดรียได้

     วิธีที่ 2 ตัดกระดาษ FTA ออกมาสกัดด้วยน้ำยา Qiagen DNA mini kit 

              ผลการทดสอบ......สามารถสกัดดีเอ็นเอออกมาได้ ใช้ทำการทดสอบ autosomal STR, Y-STR ได้ แต่ไม่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอสำหรับตรวจไมโตคอนเดรียได้

     วิธีที่ 3 ตัดกระดาษ FTA ออกมาสกัดด้วยวิธี sodium iodide

              ผลการทดสอบ......ไม่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอสำหรับตรวจไมโตคอนเดรียได้

     วิธีที่ 4 ตัดกระดาษ FTA ออกมา แล้วสกัดด้วยน้ำยา commercial ตามวิธีการของบริษัท (ได้รับความอนุเคราะห์น้ำยา commercial จาก พ.ต.ท. วรรณรัตน์  พงษ์สุวรรณ หรือน้องแหม่ม  ศูนย์ตรวจพิสูจน์ดีเอ็นเอ (หาดใหญ่) สำนักงานตำรวจแห่งชาติ)

              ผลการทดสอบ......ไม่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอสำหรับตรวจไมโตคอนเดรียได้

     เอาล่ะทีนี้ทำอย่างไรดี เพราะไม่ว่าจะใช้วิธีการใดสกัดดีเอ็นเอ ก็ไม่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอขึ้นมาได้ ปัญหาที่เกิดขึ้นจึงน่าจะมาจากตัวอย่างตรวจมากกว่าวิธีการสกัดดีเอ็นเอ  ผมก็เลยลองเปลี่ยนวิธีการทดสอบ จากที่ใช้ Taq Gold ของ Applied Biosystems ลองเปลี่ยนไปใช้ KOD Fx ซึ่งเป็น polymerase อีกชนิดหนึ่ง เปลี่ยน น้ำยา เปลี่ยนสภาวะที่เหมาะสมในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ เปลี่ยนจำนวนรอบในการทำปฏิกิริยา เปลี่ยนชนิดของ Taq polymerase มาดูผลการทดสอบครับ

     จากภาพข้างล่างนี้ เป็นการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอจำนวน 2 ตัวอย่างครับ โดยใช้ Taq Gold ของ Applied Biosystems โดย lane ที่ 1 เป็น positive control ซึ่งได้ PCR product ประมาณ 4,000 bp ในที่นี้ผมไม่ได้ใช้ marker เป็นตัวเทียบครับ แต่ใช้ pool ของ positive control เป็นตัวเทียบเพื่อตรวจสอบดูว่า ตัวอย่างตรวจที่เอามา run electrophoresis มี PCR product ขนาดเท่ากับที่เราสนใจหรือไม่ lane ที่ 2 เป็นตัวอย่างตรวจที่ 2 และ lane ที่ 3 เป็นตัวอย่างตรวจที่ 3 

     จะเห็นได้ว่า positive control  มี PCR product ขนาด 4,000 bp แต่ตัวอย่างตรวจที่ 2 และ 3 ของเราไม่มี PCR product ครับ ที่รู้ว่า positive control มันมีขนาด 4,000 bp ก็เพราะเคย run เทียบกับ DNA marker มาก่อนแล้วครับ

     ส่วนการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ โดยใช้ KOD Fx ของ TOYOBO ในตัวอย่างตรวจเดียวกัน พบว่าสามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้ครับ ดังภาพข้างล่างนี้ โดยมี PCR product ตรงกับ positive control

     นั่นหมายความว่า การใช้ KOD Fx สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอขึ้นมาได้ครับ ในขณะที่ Taq Gold ไม่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอบริเวณ control region ขนาดประมาณ 4,000 bp ได้ ถ้าจะให้สรุปว่าเกิดอะไรขึ้น คงตอบได้ยากครับ เพราะมีสภาวะของการทดสอบที่แตกต่างกันอีกหลายประการด้วยกัน แต่ถ้าคิดว่า หลักใหญ่ๆ ในการทดสอบเหมือนกัน ต่างกันที่ตัว Taq polymerase แล้ว อาจอธิบายได้ดังนี้

     ตัวอย่างตรวจที่สกัดออกมาได้นั้น น่าจะติดตัว PCR inhibitor ออกมาด้วยครับ สารยับยั้งการเพิ่มปริมาณที่ติดมานี้ น่าจะออกฤทธิ์กับ taq polymerase โดยตรงกับทำให้ไม่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้ ดังนั้นเมื่อเปลี่ยนตัว polymerase ไปเป็นชนิด KOD Fx ซึ่งเป็น polymerase ที่สกัดได้จากสิ่งมีชีวิตเซลล์เดียว แต่เป็นคนละสปีชีส์กัน ทำให้เจ้าสารยับยั้งปฏิกิริยาตัวนี้ไม่สามารถออกฤทธิ์กับ KOD ได้ครับ

     สิ่งที่น่าสนใจของเจ้า KOD Fx นี้ ก็คือ มันสามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้ยาวมากครับ ในเอกสารแนบน้ำยาบอกว่าสามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอของมนุษย์ได้ยาวถึง 24,000 bp ได้ครับ แล้วมันก็มีคุณสมบัติ proof-reading หมายถึงว่าเมื่อสร้างดีเอ็นเอเสร็จ มันมีคุณสมบัติของการเข้าไปตรวจสอบดูว่าดีเอ็นเอที่สร้างขึ้นนั้น มันสร้างขึ้นถูกหรือไม่ หากมันสร้างขึ้นผิด มันจะเข้าไปแก้ไขให้ถูกต้องได้ครับ  เป็นไงครับ น่าสนใจมั้ย

     โชคดีที่เปลี่ยนแค่ polymerase ก็หายแล้ว เพราะถ้าไม่หาย อาการนี้ สงสัยได้อีกอย่างหนึ่งครับ นั่นคือ มี mutation เกิดขึ้นที่ primer bind site  ทำให้เจ้า primer เข้าไปจับกับ DNA template ไม่ได้ หรือไม่ก็อาจจะมีการขาดหายไปของสายดีเอ็นเอบริเวณนี้ ทำให้แม้ว่าจะมี primer อยู่แต่มันก็ไม่รู้ว่าจะไปจับกับอะไรครับ การจะตรวจสอบว่าเกิดจากสาเหตุเหล่านี้หรือไม่ ก็ต้องเปลี่ยน primer ครับ .....เย้...ดีจัง....ไม่ต้องทำแล้ว

[Tanyarat]

รบกวนสอบถามด้วยค่ะ พอดีสนใจอยากลองนำมาใช้กับตัวอย่างพืช ในการใช้ KOD Fx ไปหาอ่านดูพบว่าสามารถใส่ตัวอย่างพืชโดยตรงลงใน Buffer A ไม่ทราบว่าตัว buffer นี้เขาให้มาด้วยไหมคะเวลาสั่งซื้อชุดนี้ หรือต้องเตรียม buffer เองคะ