เทคนิคนี้น่าจะเป็นเรื่องง่ายๆ สำหรับคนที่อยู่ในวงการ molecular แต่สำหรับอีกหลายคนที่ยังไม่มีประสบการณ์อาจเป็นเรื่องวุ่นวายพอสมควร ในฐานะของคนที่ไม่มีประสบการณ์เรื่องนี้มาก่อนก็ขอบันทึกไว้ให้ผู้ที่ไม่มีประสบการณ์เหมือนๆกัน ได้เข้าใจขั้นตอนนี้ให้มากขึ้น
เทคนิคนี้น่าจะเป็นเรื่องง่ายๆ สำหรับคนที่อยู่ในวงการ molecular แต่สำหรับอีกหลายคนที่ยังไม่มีประสบการณ์อาจเป็นเรื่องวุ่นวายพอสมควร ในฐานะของคนที่ไม่มีประสบการณ์เรื่องนี้มาก่อนก็ขอบันทึกไว้ให้ผู้ที่ไม่มีประสบการณ์เหมือนๆกัน ได้เข้าใจขั้นตอนนี้ให้มากขึ้น
1. ทำไปทำไม?
ทำเพื่อตรวจสอบว่า เมื่อเราสกัด DNA จากตัวอย่างตรวจแล้ว จะแน่ใจอย่างไรว่า ในหลอดทดลองที่เขาบอกว่ามี DNA อยู่นั้น มี DNA อยู่จริง ก็ต้องพิสูจน์กันหน่อย วิธีที่พิสูจน์เรื่องนี้น่าจะมีอยู่ 2 วิธีใหญ่ๆ คือ การ run electrophoresis และการวัด OD ด้วย spectrophotometer
2. แล้วไอ้สองวิธีนี้กันดีต่างกันยังไง?
วิธี electrophoresis จะได้ออกมาเป็น band เทียบกับ marker เราก็จะรู้ว่า DNA ที่ได้มี molecular weigth เท่าไร มีการแตกของเส้น DNA หรือไม่ (fragmentation) ถ้ามีการแตกของเส้น DNA ก็จะมี band ขนาด MW เล็กลง หรือ band ที่ได้ อาจไม่คมชัด  หนักกว่านั้นก็เป็น smear ซึ่งหมายถึงมี DNA ขนาดใกล้เคียงกันเกาะกันเป็นปื้น ทั้งหมดเรียกว่าคุณภาพของ DNAไม่ดี   สำหรับที่ดี คือควรได้ DNA ที่มี band คมชัด ส่วนการวัด OD ด้วย spectrophotometer ที่ 260 nm เป็นการวัดปริมาณ DNA ที่ค่อนข้างแม่นยำ โดย DNA 1 mg/ml จะวัด ODที่ 260 nm ได้ = 20 แต่การวัดปริมาณด้วยวิธีนี้เป็นการบอกเพียงแค่ปริมาณ ไม่ได้บอกคุณภาพของ DNA เหมือนวิธี electrophoresis  อ้อ! เกือบลืมไป จริงๆแล้ววิธี electrophoresis ก็สามารถคำนวณหาปริมาณของ DNA ได้ โดยใช้ standard marker ที่รู้ความเข้มข้นของ marker แล้ววัด intensity ของ band ที่ได้เทียบกับ standard ก็จะรู้ปริมาณของ DNA (หลักการเดียวกับ Densitometer) แต่ปริมาณของ DNA โดยวิธีนี้ อาจไม่แม่นยำเท่ากับวิธีการวัดด้วย spectrophotometer ส่วนใครจะใช้วิธีไหน ก็เลือกเอาตามสบายนะ
3. Gel ที่ใช้มีกี่แบบ?
สำหรับการตรวจสอบ DNA นิยมใช้ 0.5 % agarose gel (ที่นี่ใช้ Agarose Type I มันยังมี Agarose Type II ซึ่งผมยังไม่รู้ว่าเขาใช้ต่างกันอย่างไร ถ้ารู้แล้วค่อยมาบอกทีหลังก็แล้วกัน) ส่วน 2-2.5% agarose นิยมใช้ในการ run PCR product  หาก DNA มีขนาดเล็กมาก เขาก็จะเปลี่ยนไปใช้ polyacrylamide gel แทน
4. แล้วทำไมไม่ใช้ agarose gel สำหรับงาน DNA ที่มีขนาดเล็กล่ะ?
เรารู้ในหลักการว่า DNAขนาดใหญ่จะวิ่งได้ช้า DNA ขนาดเล็กจะวิ่งได้เร็ว  ถ้าต้องการแยก DNA ขนาดเล็กให้มันวิ่งได้ช้าขึ้น ก็เพิ่มความเข้มข้นของ gel ให้สูงขึ้น แต่ agarose gel มีข้อจำกัดในการเตรียม กล่าวคือ ที่ความเข้มข้นมากกว่า 8 % gel จะมีความแข็งมาก เตรียมให้ได้คุณภาพที่ดียาก ก็เลยเปลี่ยนไปใช้ polyacrylamide gel ซึ่งสามารถเตรียมที่ % สูงๆ ได้ดีกว่า แม้กระทั่งที่ 20% ก็ยังไม่มีปัญหา
5. ขั้นตอนการทำเป็นอย่างไร?
เริ่มแรกเตรียม 0.5% agarose gel (0.23g agarose ใน 0.5% TAE buffer 45 ml ผมเตรียมเท่าที่พอใช้ ใครจะเตรียมมากกว่านี้ก็คำนวณเองนะ)  ต้มใน microwave (กะให้ได้อุณหภูมิ 80-90C ที่อุณหภูมิขนาดนี้ มันจะเริ่มเดือดเล็กๆพอเห็นเป็นฟอง ไม่ใช่เดือดพลั่กๆ) เอามาทำให้เย็นโดยแช่น้ำให้ได้อุณหภูมิประมาณ 40-45C ตรวจสอบโดยใช้มือจับแล้วรู้สึกว่าอุ่นน้อยๆ  ที่เขาไม่เท gel ตอนที่ยังร้อนอยู่เนื่องจากวัสดุที่ใช้ทำจากพลาสติก ถ้า gel ร้อนมากๆ พลาสติกอาจงอได้ โดยเท gel ให้สูงประมาณ 5 mm ก่อน แล้วขยับให้ gel ไหลไปทั่วทั้งเพลท แล้วจึงเทเพิ่มให้หมด เสียบ Comb แล้วรอให้ gel แข็ง (ประมาณ 20 นาที) ถอด Comb ออก เช็ดเอาเศษ gel ที่เกาะบนเพลทออก หากยังไม่ใช้ก็เก็บไว้ใน 0.5% TAE buffer ได้ แต่หากจะใช้เลยก็เอาไปใส่ในเครื่อง electrophoresis ที่มี 0.5% TAE buffer อยู่ สังเกตปริมาณ buffer ต้องท่วมเนื้อ gel
ผสม DNA กับสีย้อม โดยใช้อัตราส่วน 5:1 คือ DNA 5 ul ต่อสีย้อม 1 ul ขั้นตอนนี้นิยมทำบนแผ่น paraffin โดยหยดสีย้อมเป็นจุดๆ จุดละ 1 ul ให้เป็นแถวห่างๆกัน แล้วดูด DNA 5 ul เข้าไปผสม แล้วดูดสารทั้งหมดเอามาหยอดใน well ทำเช่นนี้ไปจนหมด อ้อ! อย่าลืมหยอด marker เข้าไปด้วยล่ะ เสร็จแล้ว ทำการ set เครื่อง electrophoresis ที่นี่บังคับให้หันหัว gel (ด้านที่มีหลุมหยอดตัวอย่าง DNA) ไปทางขวามือ เพราะฉะนั้นก็ set ให้ขั้วบวกอยู่ทางซ้าย ขั้วลบอยู่ทางขวา DNA ก็จะวิ่งจากขั้วลบไปทางบวก set Voltage 100 V เวลา 15 นาที (ตอนแรกผมใช้ 30 นาที senseiบอกว่า DNA band ที่ไปมันไปทับกับแถบสี่ย้อม DNA พอดี ก็เลยลดเวลาลง) เสร็จแล้วเอาgel ไปย้อมด้วย Ethidium bromide 10 นาที ก่อนจะนำไปเข้าตู้เปิดแสง UV แล้วถ่ายรูป
5. gel ที่ทำเสร็จแล้ว ถ่ายรูปแล้ว เอาไปไหน?
เท่าที่ผมรู้ บ้านเรานิยมเก็บไว้ เก็บทั้งรูปถ่าย เก็บทั้งแผ่น gel จนสุดท้ายจบโปรเจคแล้วค่อยทิ้งกัน  แต่ที่นี่เขาเอากลับมาใช้ใหม่ พอถ่ายรูปเสร็จเขาก็จะเอา gel ใส่ใน flask พอจะใช้เขาก็เอา gel ใน flask นี้ไปต้ม แล้วเอามาเทเพลทใหม่ได้เลย ใช้ไปหลายครั้ง จนสีของ gel มันเข้มจนรับไม่ได้แล้วค่อยเตรียมใหม่ ถ้าไม่ได้มาเห็นด้วยตาตัวเอง รับรองยังไงก็เลือกเตรียมใหม่ ไม่กล้าใช้ gel เก่าหรอก
จบแล้ว.......
หมายเหตุ :  ผมบันทึกจากที่ได้เรียนรู้ และซักถาม ดังนั้นหากตกประเด็นใดไป หรือเหตุผลประกอบอาจไม่ถูกต้องครบถ้วน ขอเชิญท่านผู้เชี่ยวชาญในงาน molecular ทั้งหลายช่วย comment หรือให้เหตุผลประกอบที่ถูกต้องด้วย เพื่อผู้ด้อยประสบการณ์ทั้งหลายเช่นผม จะได้เข้าใจ และทราบเหตุผลที่แท้จริงครับ
หมายเหตุอีกครั้ง  ใครรู้ช่วยบอกด้วยว่าเขาใส่ คำหลักในบันทึกกันอย่างไร ผมอ่านวิธีการแล้วไม่ค่อยเข้าใจ