บันทึกจากแดนซากุระ 2: วิธีการสกัด DNA

เมื่อวานนี้ มีโอกาสดีที่ได้เตรียม NaI Solution สำหรับสกัด DNA ด้วยความไม่รู้ ประกอบกับนักศึกษาหลายคนในที่นี้ ไม่เคยมีใครเตรียมสารตัวนี้มาก่อนเลย เริ่มเตรียมกันตั้งแต่ 5 โมงเย็น จนเกือบ 2 ทุ่มครึ่ง NaI ก็ยังไม่ละลายเลย เอาไป heat ก็แล้ว ทำอย่างไรก็ไม่ละลาย จนกระทั่งเจอ Sensei พอแกแนะนำใช้เวลาไม่ถึง 10 นาทีก็เสร็จ แน่นอนมันมี trick สำหรับคนที่ไม่รู้เรื่องอย่างเรา ก็ต้องลองผิดลองถูกไปก่อน แล้วเดี๋ยวจะเล่าให้ฟัง

ผมคิดว่าเพื่อเป็นการบันทึกไว้ ให้ได้ประโยชน์สูงสุด ผมขอแสดง protocol สำหรับการสกัด DNA ด้วยวิธีนี้ไว้ด้วยจะดีกว่า

1. whole blood (sample) 0.5 ml

2. Lysis solution 0.5 ml

3. centrifuge 10,000 g for 3 min

4. ค่อยๆ เท solution ทิ้ง แล้วคว่ำปากหลอดกับกระดาษทิชชู จะสังเกตเห็นตะกอนสีขาวอยู่ก้นหลอด

5. เติม 1 ml Lysis buffer ผสมให้เข้ากัน แล้วนำไปปั่นที่ 10,000 g เป็นเวลา 3 นาที ทำขั้นตอนที่ 4 และ 5 ซ้ำ 2 ครั้ง

6. เติม Enzyme reaction solution 0.2 ml

7. เติม 20 ug/ml RNase A (อาจจะเติมหรือไม่ก็ได้ ขึ้นกับว่าต้องการทำลาย RNA หรือไม่)

8. incubate ใน heating block อุณหภูมิ 50 C เป็นเวลา 10 นาที (ขั้นตอนนี้ใน paper ใช้ที่ 37 C)

9. เติม Proteinase solution 10 ul

10. incubate ใน heating block อุณหภูมิ 50 C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง (ในpaper ใช้ที่ 37 C)

11. เติม NaI Solution 0.3 ml ค่อยๆผสมให้เข้ากัน โดยการปิดฝา แล้วคว่ำ tube ไปมา ขั้นตอนนี้จะเห็นตะกอนสีขาวอยู่ระหว่างชั้นของ reagent เมื่อผสมให้เข้ากันแล้ว จะเป็น ตะกอนขุ่นทั้งหลอด

12. เติม 2-isopropanol 0.5 ml ตะกอนที่ขุ่นจะกลับใส

13. centrifuge 10,000 g for 10 min

14. เทน้ำใสออก เหมือนขั้นตอนที่ 4

15. เติม 40% isopropanol 1 ml ค่อยๆผสมให้เข้ากัน โดยการปิดฝา แล้วคว่ำ tube ไปมา

16. ปั่นที่ 10,000 g 5 นาที

17. เทน้ำใสออก เหมือนขั้นตอนที่ 4

18. เติม 70% EtOH 1 ml ค่อยๆผสมให้เข้ากัน โดยการปิดฝา แล้วคว่ำ tube ไปมา

19. ปั่นที่ 10,000 g 5 นาที

20. เทน้ำใสออก เหมือนขั้นตอนที่ 4

21. นำไป vacuum dry ประมาณ 10 นาที ถ้า alcohol ยังระเหยไม่หมด ให้เพิ่มเวลา หรือนำไปอบที่ 65 C แล้วเปิดดูทุกๆ 5 นาที จนกว่า alcohol จะระเหยหมด

22. resuspend ใน TE buffer 0.1-0.5 ml (ขึ้นกับปริมาณ DNA ที่ได้) ไม่ต้องผสม ให้ตั้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง ข้ามคืน (ที่นี่อุณหภูมิราว 25 C)

การตรวจสอบว่ามี DNA หรือไม่ให้ run Electrophoresis ด้วย 0.5% agarose gel set voltage 100 V for 15 นาที นำไปย้อมใน Ethidium bromide 10 นาที แล้วนำไปถ่ายรูป

น้ำยาที่ใช้

Lysis buffer

1%(w/v) Triton X-100

0.32 M Sucrose

5 mM MgCl2

10 mM Tris-HCl pH 7.5

Enzyme reaction solution

1% (w/v) SDS

5% mM EDTA-Na2

10 mM Tris-HCl pH 8.0

RNase A (can be obmitted)

20 ug/ml RNase A

Proteinase solution

17 mg/ml proteinase K

NaI solution

7.6 M NaI

20 mM EDTA-Na2

40 mM Tris-HCl pH 8.0

ทีนี้กลับมาสู่ขั้นตอนการเตรียม NaI ที่ถูกต้อง  ที่นี่เตรียมคราวละ 50 ml

ผสม EDTA กับ Tris-HCl ให้เข้ากันก่อน เติมน้ำ DI เพิ่มประมาณ 15-20 ml (เตรียมใน beaker) ใช้ช้อนตักสาร NaI ค่อยๆ เติมลงใน solution จนกว่าจะหมด สังเกตได้ว่ายังเป็นตะกอนละลายไม่หมด ให้ถ่าย solution ที่เตรียมนี้ลงในกระบวกตวง ปรับปริมาตรด้วยน้ำ DI จนได้ปริมาตร ประมาณ 44 ml ทีนี้ก็ตั้งใจคนให้ละลาย แป๊บเดียวก็เสร็จ เก็บที่ 4 C ในขวดสีชา

เห็นไหม ง่ายจะตาย แต่กว่าจะรู้ งมโข่งไปตั้งนาน 3ชั่วโมงครึ่งกับการลองผิดลองถูก  ถามว่าคุ้มมั้ย คิดว่าคุ้มนะ เพราะมันทำให้เราจำไปจนตาย

หน้าที่ของสารแต่ละตัว

Lysis solution (contain 1% TritonX-100) ทำหน้าที่ break cell membrane

Enzyme reaction solution (contain 1% SDS) ทำหน้าที่ break nuclear membrane

RNase A ทำหน้าที่ย่อย RNA ปริมาณที่ใส่บางครั้งอาจย่อยไม่หมด เมื่อ run electrophoresis จะเห็น band ของ RNA วิ่งอยู่ตอนปลายของ gel

Proteinase solution ทำหน้าที่ย่อย protein

NaI solution ทำหน้าที่แยก protien น้ำตาล หรืออะไรก็ตามที่เกาะกับ DNA ให้หลุดออกมา เหมือนหน้าที่ของ Phenol Chloroform

Isopropanol ทำหน้าที่ตกตะกอน DNA

40% isopropanol ทำหน้าที่ล้าง DNA

70% Ethanol ทำหน้าที่ล้าง DNA แต่ด้วยเปอร์เซนต์ที่สูงขึ้น จึงทำให้แห้งได้ง่ายขึ้น ในขั้นตอนนี้หาก ไม่แห้ง ยังมี ethanol เหลืออยู่ เมื่อละลาย DNA ด้วย TE buffer แล้ว ethanol อาจ inhibit ปฎิกิริยาของ enzyme เช่นในกรณีที่ทำ PCR เป็นต้น ขึ้นกับปริมาณของ ethanol ที่ตกค้างอยู่ ทางที่ดี คือกำจัดออกไปให้มากที่สุด

ซ้ำอีกที ทั้งหมดนี้ มาจาก Reference

Lu Wang, Kazunari Hirayasu, Masaki Ishizawa and Yoshiteru Kobayashi.  Perification  of genomic DNA from human whole bolld by isopropanol-fractionation with concentrated NaI and SDS.  Nucleic Acids Research 1994; 22(9):1774-1775.

[mitochodria]

ขอเพิ่มเติมนิด เพื่อให้กระจ่างขึ้น

ใช้ NaI 50 g

500 mM EDTA-Na2 จำนวน 1.75 ml

500 mM Tris-HCl pH 8.0 จำนวน 3.51 ml

ทุกอย่างนี้ต้องผสมกันให้ได้ total volume of 43.9 ml

[พี่เม่ย]

เขียนยาวๆตั้งสองบันทึกแล้ว ไม่ฝากความคิดถึงคนที่บ้านบ้างหรือคะ?

[โอ๋-อโณ]

ขอบคุณสำหรับข้อมูลที่ละเอียดละออค่ะ มีหลายอย่างที่ทำให้ระลึกชาติได้สมัยที่ไปเริ่มทำแลบกับชาวต่างชาติเหมือนกัน โดยเฉพาะเรื่องทำใจไม่ได้กับ disposible ทั้งหลาย ทำมาสี่ห้าปีก็ยังรู้สึกอยากเก็บกลับบ้านเราอยู่เลย

เขียนได้ดีมากค่ะ อย่าลืมปลีกเวลามาเขียนแบบนี้ทุกวันนะ จะคอยอ่าน คนที่บ้านเค้าก็คงเขียนถึงต่างหากแล้วละมังคะ พี่เม่ย

[mitochodria]

ขอบคุณครับ สำหรับกำลังใจให้คนที่อยู่ไกล  หากมีโอกาสจะหาเวลามาเขียนบ่อยๆ  ส่วนสำหรับคนที่บ้าน ไม่ได้เขียนจดหมายครับ ใช้วิธีโทรไปหา  ได้ยินเสียงแล้วนอนหลับสบาย

[toe]

ผมเข้ามา search หาข้อมูลบางอย่าง เผอิญมาเจอเลยอยากฝากถาม sensei ว่าทำใช้ NaI แทน phenol-chloroform ล่ะครับ มันถูกกว่าหรือ ปลอดภัยกว่าหรือครับ ถ้าดีจริงๆอาจจะเอามาลองใช้ดูบ้างครับ เพราะผมคิดว่า ยhenol ค่อนข้างอันตราย แถมใช้ยังมี waste ที่เป็นอันตรายอีก ขอบคุณครับผม

[Mitochondria]

คุณ toe

• วิธีสกัดดีเอ็นเอ ด้วย NaI ตาม paper ที่อ้างอิงข้างบนนั้น สามารถสกัดดีเอ็นเอ ได้มากกว่าวิธี phenol-chloroform ประมาณ 1.7 เท่าครับ
• สารเคมีที่ใช้ไม่มีอันตรายครับ ไม่เหมือน phenol
• ส่วนการสกัด ไม่ได้แตกต่างกันครับ
• แต่วิธีนี้เคยมีคนบอกไว้ว่า เกลือ NaI อาจรบกวนปฏิกิริยา PCR ได้ แต่เท่าที่ผมเคยทำนั้น ยังไม่เคยเจอครับว่ารบกวนปฏิกิริยา PCR เพราะทุกรายที่ทำมา ไม่น้อยกว่า 500 ราย ไม่เคยมีปัญหาครับ
• น้ำยาสกัดแบบนี้ ปัจจุบันมีจำหน่ายเป็น commercial kit ครับ ในญี่ปุ่นมีขายอยู่
• แน่นอนครับ สำหรับราคา เพราะทุกอย่างเตรียมได้หมด ราคาถูกกว่าแน่ๆครับ น้ำยาก็พื้นๆ ไม่มีอะไรพิเศษครับ ยกเว้นการเตรียม Sat. NaI ซึ่งผมบอกวิธีการเตรียมไว้ข้างบนแล้วครับ

[นริสรา]

อยากถามพี่ว่า วิธีนี้จะสามารถนำมาใช้กับการสกัดดีเอนเอของแบคทีเรียได้ไหมคะ ถ้าได้แล้วพี่พอจะทราบไหมคะว่าจะต้องเปลี่ยนสารอะไรรึเปล่าคะ เพราะว่าวิธีนี้ได้ดีเอนเอมากกว่า และไม่มีผลกับการทำพีซีอาร์ ขอความกรุณาด้วยค่ะ ขอบคุณค่ะ

[Mitochondria]

คุณ นริสรา

วิธีนี้ใช้สกัดดีเอ็นเอของแบคทีเรียได้เช่นเดียวกับวิธี phenol chloroform ครับ ใช้วิธีการเช่นเดียวกับวิธี phenol chloroform ครับ เพียงแต่ขั้นตอนที่ใช้ phenol chloroform isoamyl alcohol ก็ปรับมาใช้ NaI กะ isopropanol แทนครับ ไม่จำเป็นต้องเปลี่ยนแปลงสารต่างๆ ไปจาก protocol ข้างบนครับ

[thidarat]

สวัสดีคะ

พอดีเข้ามาหาข้อมูล เพิ่มเติมสอนหนังสือ พยายามหลีกเลี่ยง Phenol อยู่ด้วย ขอบคุณมากเลยค่ะ

[thidarat]

สวัสดีคะ

ตอนนี้จะเอาไปใช้จริงนะคะ แล้วจะส่งผลมาบอกคะ มีอะไรใหม่update อีกนะคะ เป็นประโยชน์มากคะ เคยไปทำแลปที่ญี่ปุ่น ก็ได้อะไรชที่ชาวเราไม่ค่อยนึกถึงมาเหมือนกันคะ ไว้ล่าสู่กันฟังคราวหน้านะคะ

[pcr]

ผมอยากได้ วิจัยที่เกี่ยวกับ การสกกัดดีเอ็นเอของพาวแบคทีเรีย ว่าเค้าทำยังไง ใช้เอนไซม์อะไรตัดบ้าง จะหาได้ที่ไหนครับ

มีใครพอหาได้บ้าง รบกวนหน่อยนะครับ เว็บไซน์ที่ ข้อมูลดีหน่อย

[Sri-arun]

สวัสดีค่ะ

          ก่อนอื่น ต้องขอบคุณมากนะคะ สำหรับความรู้ที่นำมาแบ่งปัน พอดีเริ่มเรียนต่อระดับปริญญาโทค่ะ เพิ่งจะเรียนรายวิชาจบไป  เทคนิคต่างๆของการทำวิจัยยังไม่ค่อยมีมากเท่าไร ยอมรับว่าอยู่ในระดับพื้นฐานมากจริงๆ ค่ะ  ได้อ่านอันนี้ เห็นว่าเข้าใจง่ายดี จะนำไปใช้ดูเทียบคู่กับ  paper ที่อ้างอิงมาอีกทีค่ะ  และจะติดตามอ่้านความรู้อื่นๆต่อๆไปด้วยค่ะ

[[email protected]]

เลือดที่ใช้สกัด แช่ -20 องศา ไว้ ประมาณ 1 ปี จะใช้สกัดได้มั้ยคะ

[min]

ทำแลบแบนี้เหมือนกันค่ะสกัด DNA จากเเบคทีเรีย แต่อาจารย์ให้ทำ2แบบคืออันนึงต้มอีกอันนึงไม่ต้ม อยากทราบค่ะว่ามันมีผลต่อการสกัด DNA ไหมค่ะ