ปัญหาของ PCR...คำถามที่น่าจะเอามาแลกเปลี่ยนกัน

 เป็นปัญหาที่คำตอบจากประสบการณ์...คือสิ่งที่ดีที่สุดค่ะ 

ได้รับคำถามเกี่ยวกับ PCR ที่คิดว่า คงเป็นปัญหาที่หลายๆคนอาจจะพบเจอ และน่าจะนำมาแลกเปลี่ยนพูดคุยกันได้ทางบล็อกนี้ ก็เลยขอนำมาคั่นรายการ Basic Real-time PCR เสียก่อน เป็นปัญหาเกี่ยวกับ primer ที่มีใจความคำถามดังนี้ค่ะ

"อยากทราบว่าในการทำ PCR ปํญหาที่อาจเกิดขึ้นจะแก้อย่างไร เช่น ถ้า Forward and Reward Primer มีค่า Tm ต่างกัน จะทำอย่างไร  อุณหภูมิของ step ที่3 (elongation)จะใช้เท่าไรดูจากตัวแปรไหนบ้างคะ  อัตราการต่อสายหาได้ยังไงคะ และสุดท้ายวิธีลด non-specific band ทำอย่างไรได้บ้าง รบกวนช่วยตอบข้อสงสัยหน่อยนะคะ หรือช่วยแนะนำข้อมูลหรือหนังสือก็ได้ค่ะ"

จากประสบการณ์ของตัวเองพบว่า การทำ PCR นั้นเป็นวิธีการที่เรียกได้ว่าเป็นศิลปะอย่างหนึ่งทีเดียว ไม่มีคำตอบตายตัวใดๆ ทุกอย่างเป็น empirical process ทั้งนั้น และคนที่มีความคิดยืดหยุ่นโดยใช้หลักการพื้นฐานทางชีวเคมีจะสามารถแก้ปัญหาได้หลากหลายรูปแบบ ทฤษฎีมีไว้ช่วยในการคิดเท่านั้นเองค่ะ เพราะฉะนั้น สิ่งที่ต้องมีอย่างแรกก็คือ ความรู้พื้นฐานเกี่ยวกับส่วนประกอบต่างๆของ PCR ซึ่งจะหาอ่านได้หลากหลายที่มากๆค่ะ

สำหรับ 2-3 คำถามข้างบนนี้ มีความรู้พื้นฐานที่ใช้หาคำตอบได้ที่นี่ ( เป็นส่วนหนึ่งของ The Bio-Web ซึ่งเป็นเว็บไซต์ที่ Dr. Andrew Kropinski แห่ง Queen's University ของแคนาดาได้จัดทำขึ้นเพื่อเป็นวิทยาทาน เห็นว่าเป็นที่รวมของสิ่งที่มีประโยชน์มากๆค่ะ) เอาให้ตรงคำถามจริงๆ ก็คือ

  • สำหรับคำถามแรก อยากให้ลองเข้าไปใช้โปรแกรม Primer3 ที่มีลิงค์จากเว็บไซต์นั้นแหละนะคะ ใส่ sequence ที่ต้องการ amplify เข้าไป พร้อมกับ primer ตัวใดตัวหนึ่ง (จะเป็น forward หรือ reverse ก็ได้ค่ะ) แล้วจะได้รับ primer ที่จะมาคู่กับตัวที่เราใส่เข้าไปหลายๆตัว ถ้าไม่มีตัวไหนเหมือนตัวที่เรามีเลย น่าจะแสดงว่าเราควรจะเปลี่ยน primer ค่ะ เพื่อให้ Tm ไปกันได้ ไม่ต่างกันมาก จากประสบการณ์ตรงของตัวเองนี่ บอกได้เลยว่า การตัดสินใจเปลี่ยน primer จะเสียเวลาและค่าใช้จ่ายน้อยกว่าการทนทู่ซี้ optimize primer set ที่ค่า Tm ไปด้วยกันไม่ได้นะคะ
  • คำถามที่สอง ปกติถ้าใช้ Taq polymerase ก็จะเป็น 72 C อยู่แล้วค่ะ อุณหภูมิตรงนี้ก็จะขึ้นกับเอนไซม์ที่เราใช้ extend สาย nucleotide ของเรานั่นเองค่ะว่าเขาทำงานได้ดีที่อุณหภูมิเท่าไหร่ ต้องศึกษาจากคุณสมบัติของเขาทั้งอุณหภูมิและอัตราการต่อสายนะคะ
  • ส่วนการลด non-specific band นั้นก็คือการ optimize reaction ของเรา ซึ่งอันนี้ก็จะต้องเริ่มจากการทดลองด้วยสภาวะพื้นฐานก่อน จะดูได้จากตารางที่มีส่วนประกอบของการทำ PCR จากลิงค์ที่ให้นี้ แล้วลอง run ดูก่อนที่จะปรับความเข้มข้นของส่วนประกอบต่างๆ สำหรับตัวเองจะเริ่มที่การปรับ Mg++ ค่ะ   

หวังว่าจะมีท่านอื่นๆที่เคยพบปัญหานี้แล้วแก้ไขแบบอื่นๆ จะเข้ามาแลกเปลี่ยนประสบการณ์กันนะคะ ใครที่กำลัง optimize reaction อยู่อยากถามอะไรอื่นๆอีก ก็จะได้ใช้เป็นศูนย์กลางติดต่อกันได้ค่ะ

บันทึกนี้เขียนที่ GotoKnow โดย 

 หมายเลขบันทึก: 115585
 เขียน:  
 ดอกไม้:  ความเห็น: 123  อ่าน: คลิก 
 สัญญาอนุญาต: สงวนสิทธิ์ทุกประการ
 แจ้งลบ
 
 แจ้งลบ

ความเห็น

รายการนี้มีมากกว่า 100 ความเห็น อ่านทั้งหมด   อ่าน
kook
IP: xxx.246.45.240
เขียนเมื่อ Mon Dec 10 2007 10:26:53 GMT+0700 (ICT)

ผมขอข้อมูลเกี่ยวกับ การสร้าง pcr หน่อยได้ไหมคับ และก้อหลักการขอองมันอะคับ

ขอบคุณคับ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Wed Dec 12 2007 22:38:08 GMT+0700 (ICT)
คุณ  kook ลองตามลิงค์ในบันทึกข้างบนไปนะคะจะได้คำตอบค่ะ
son
IP: xxx.7.137.229
เขียนเมื่อ Tue Jan 15 2008 23:37:29 GMT+0700 (ICT)

สวัสดีค่ะ

ขออนุญาตถามอาจารย์เกี่ยวกับเรื่อง SyBr green ในการทำ real time PCR ค่ะ เพราะว่าเจอปัญหาคือเมื่อใส่  SyBr green เข้าไปแล้วทำให้  reaction ไม่เกิด เหมือน SyBr green เป็นตัวไป inhibit ซึ่งจริงๆแล้วไม่น่าจะมีผลต่อ reaction ก็เลยเปลี่ยนความเข้มข้นของ SyBr green จาก 10X เป็น 1X  (total volume 25 ul )ก็ดีขึ้นค่ะ reaction เกิดได้เหมือนเดิม แต่ peak ที่ได้ไม่สูงมาก และ ทำไมตำแหน่งของ peak ไม่เหมือนเดิม เมื่อทำ PCR ในครั้งถัดไป

รบกวนอาจารย์ช่วยตอบปัญหาด้วยนะคะ

ขอบพระคุณมากค่ะ 

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Wed Jan 16 2008 01:07:53 GMT+0700 (ICT)
ปกติเวลาทำ real-time PCR ที่ใส่ SYBr green เราต้องเพิ่มความเข้มข้นของ Mg++ ค่ะ ทำให้ใช้ในช่วงที่ค่อนข้างสูงกว่าใน PCR ธรรมดา ต้องลอง optimise ดูว่าควรใช้เท่าไหร่ จึงจะได้ reaction curve ที่เหมาะสมนะคะ (จาก 1.5 mM ถึง 4 mM น่ะค่ะ) และควรจะใช้ 1x SYBr green เท่านั้นค่ะ และถ้าจะให้ดีก็ควรจะ aliquot ไว้เป็น 5x  เยอะหน่อยแล้วเอามา dilute ตอนทำจะช่วยลด variation ของ peak ได้ค่ะ หนูหมายถึง peak ของ melting curve ใช่ไหมคะ เพราะอุณหภูมินี้จะขึ้นกับ solution ที่ PCR product เขาอยู่ ถ้าเรา vary อะไรไปนิดเดียวเขาก็เปลี่ยนได้บ้างค่ะ ทำให้ต้องควบคุมการใช้ pipette ให้แม่นยำมากๆ สำหรับ real-time PCR เพราะ volume ที่ใช้ก็น้อยมากอยู่แล้วนะคะ ถ้าไม่เชี่ยวชาญชำนาญจริงๆควรจะใช้ kits ที่เขาผสมSYBr green เป็น master mixs มาให้แล้วจะได้ผลแม่นยำและ comparable กว่าด้วยค่ะ
son
IP: xxx.7.139.47
เขียนเมื่อ Thu Jan 17 2008 23:15:58 GMT+0700 (ICT)

ขอบพระคุณอาจารย์มากนะคะ

หนูจะลองทำดูนะค่ะ 

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Fri Feb 15 2008 23:16:31 GMT+0700 (ICT)
คำถามของน้อง Son กินพื้นที่ยาวมากค่ะ ขออนุญาตลบแล้วเอามาใส่ในคำตอบไปเลยนะคะ  
6. Son
เมื่อ ศ. 15 ก.พ. 2551 @ 18:01
547521 [ลบ]

สวัสดีค่ะอาจารย์

หนูรบกวนถามอาจารย์ค่ะว่า หนูทำ real time PCR ได้ melt peak ที่ค่อนข้างห่างกัน โดยทำเป็นแบบแยกหลอดได้อุณหภูมิ ประมาณ 87 กับ 91 องศา แต่พอเอา primer ที่ใช้มารวมกัน ทำเป็น multiplex ทำให้ปฏิกิริยาไม่เกิด เห็นแต่ primer dimer หนูไม่ทราบว่าจะมีปัจจัยอะไรทำให้มีผลต่อปฏิกิริยา หนูเลยจะขอคำแนะนำสำหรับการทำ real time แบบ multiplex ค่ะ เพราะลองทำมาหลายครั้งแล้ว ก็ยังไม่ได้

ขอบพระคุณมากค่ะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Fri Feb 15 2008 23:33:35 GMT+0700 (ICT)

ขออธิบายคร่าวๆถึงสาเหตุที่น่าจะเป็นนะคะ

ข้อแรก การดู melt peak เป็นการดู PCR product ซึ่งอุณหภูมิที่มันแยกจากกันนั้นไม่เกี่ยวกับอุณหภูมิตอนทำ PCR นะคะ เพราะฉะนั้นไม่สามารถจะเอามาเป็นตัวบอกว่าเราจะสามารถทำ multiplex กับ products 2 ตัวนี้ได้ เพราะการจะทำ multiplex PCR ให้ได้ product 2 ตัวนั้นสิ่งที่ต้องคำนึงมากๆก็คือ primers คู่ที่ใช้น่ะค่ะ ถ้า sequence ของทั้ง 4 ตัวมีแนวโน้มจะ anneal กันเองมากกว่าจะไป anneal กับต้นแบบที่เราต้องการ amplify ก็จะเกิดปัญหาอย่างที่หนูพบนี่แหละค่ะ

หนูต้องไปเช็คดู primers ทั้ง 2 คู่ของหนูด้วยโปรแกรมเช่น Primer3 (free on web หาจากพี่ Google ได้ค่ะ) ถ้าหากว่าพอใส่ทั้ง 2 sets เป็น multiplex แล้วได้แต่ primer dimer ก็มีแนวโน้มว่า เจ้า primers ทั้ง 4 ชิ้นของหนู เขาชอบเกาะกันเองมากกว่าจะไปทำหน้าที่ต่อสายเจ้า product ที่เราต้องการจริงๆ น่าจะต้อง design primers ใหม่นะคะ แล้วก็ตรวจสอบจากโปรแกรมต่างๆที่ใช้ในการ design primers นี่แหละค่ะว่า sequence ของ primers จำเพาะกับ template มากกว่า คู่ primers ที่เราจะใส่มันลงไปพร้อมกัน ไม่ง่าย แต่ไม่ยากนะคะ ได้ผลยังไงเขียนมาคุยกันใหม่ได้นะคะ

son
IP: xxx.12.97.116
เขียนเมื่อ Tue Mar 11 2008 14:06:36 GMT+0700 (ICT)

สวัสดีค่ะอาจารย์

    หนูมีปัญหารบกวนถามอาจารย์อีกแล้วค่ะว่าหนูใช้ primer set ทำแบบ multiplex โดยทำแบบ conventional ซึ่งก็ได้ band ที่ดี แต่พอนำ primer set นี้มาทำเป็น multiplex เหมือนกันแต่เป็นแบบ real time กลับมี reaction ที่ไม่ดี ลองปรับ MgCl แล้วก็ไม่ดีขึ้น ไม่ทราบว่าจะต้องแก้ปัญหาอย่างไร จะต้องเปลี่ยน primer ใหม่หรือไม่ และอยากทราบว่าเราจะใช้ gene อะไรเป็น internal control ในการทำ real time ได้บ้างค่ะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Wed Mar 12 2008 23:48:02 GMT+0700 (ICT)

เรื่อง multiplex PCR ในเครื่อง real time นี่คงจะยิ่งซับซ้อนกว่าในเครื่องแบบ conventional นะคะ พี่โอ๋ยังไม่เคยลงมือทำเองเลย เท่าที่จำได้รู้สึกว่าเคยแนะนำคนที่จะลองให้เอา PCR product ที่ได้จากวิธีธรรมดาใส่ SYRBG ลงไปแล้วลองเอาไป run melting curve analysis ดูว่า product ที่ได้ใน reaction buffer ที่เราใช้มีลักษณะเหมือนกันหรือต่างกันยังไง ไม่ได้ติดตามผลค่ะ (ตั้งแต่ตอนอยู่ออสเตรเลียโน่น) แต่รู้สึกว่าเขาก็ทำได้ด้วย primer set ชุดเดิมที่ทำในเครื่องธรรมดานะคะ แค่ปรับ conditions เอาทั้ง Mg++ conc. และ annealing temp. น่ะค่ะ

ลองค้นดูใน internet พบว่ามีโปรแกรมที่ design primers สำหรับ multiplex PCR หลายที่ ชิ้นนี้ฟรีที่ http://www.zaik.uni-koeln.de/AFS/Projects/Bioinformatics/mpxprimer.html

ลองเข้าไปดูแล้ว เช็คว่า primers และ condition ที่เราใช้นั้น โปรแกรมเขาบอกว่ายังไง ต้องปรับเปลี่ยนอะไร

คิดว่าถ้า work ในเรื่องธรรมดา น่าจะพอปรับให้ run ด้วย real-time ได้นะคะ คงไม่ถึงกับต้อง design primer ชุดใหม่ ขอให้โชคดีทำสำเร็จนะคะ

โอ๋-อโณ
IP: xxx.12.73.8
เขียนเมื่อ Thu Mar 13 2008 12:50:35 GMT+0700 (ICT)

ลืมตอบเรื่อง internal control ไปค่ะ จะใช้ก็เมื่อต้องการทำ quantification ค่ะ ใช่ที่ต้องการหรือเปล่าคะ เพราะถ้าเราจะวัดปริมาณของ gene อะไร เราก็ต้องวัด gene อื่นๆที่เรารู้ว่ามีคงที่ในระบบนั้นๆ การเลือกตัวไหนก็เลยจะขึ้นอยู่กับว่าหนูทำการทดลองระบบอะไรน่ะค่ะ เช่นถ้าเป็น human blood ก็ใช้ beta-actin หรือ GAPDH บาง paper เขาก็แนะนำให้ใช้ 18S RNA แต่ถ้าไม่ใช่วัดปริมาณก็ไม่จำเป็นต้องมี internal control หรอกค่ะ ขอให้หนูโชคดีนะคะ

son
IP: xxx.7.137.6
เขียนเมื่อ Fri Mar 14 2008 00:55:04 GMT+0700 (ICT)

ขอบคุณอาจารย์มากๆค่ะ หนูจะลองไปศึกษาเพิ่มเติมดูค่ะ

pookpic
IP: xxx.9.163.247
เขียนเมื่อ Mon Mar 31 2008 20:46:59 GMT+0700 (ICT)

อยากสอบถามเกี่ยวกับการamp pcrค่ะ คือหนูextract dna แล้วcheck product ทั้งหมด10 รายมีครบ แต่ทำไมเวลาทำpcr แล้วปรากฏว่ามันมีband แค่ 2 รายแต่อีก 8รายไม่ขึ้น band เลยทั้งๆที่ทำพร้อมกันเหมือนกันเลย

ส่วน primer dimer ก็เยอะมาก(อยากรู้วิธีคำนวณ condition) และลองทั้งเพิ่มปริมาณdna และ dilute dna แล้วค่ะก็ยังไม่ขึ้น รบกวนไขปัญหาด้วยค่ะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Thu Apr 03 2008 00:19:38 GMT+0700 (ICT)

สำหรับคำถามของคุณ pookpic นั้น พี่โอ๋อยากให้ลองเริ่มจากการวัดความเข้มข้นของ DNA ที่ extract มาได้ดูก่อนนะคะ เพราะถ้าทำ PCR เหมือนกันในชุดเดียวกัน (หมายถึงใช้ mastermix เดียวกัน) แล้วได้ product จากแค่ 2 รายอีก 8 ไม่ขึ้น ก็อาจจะเป็นเพราะจุดเริ่มต้นต่างกันได้ด้วยเหมือนกัน

แต่ถ้าบอกว่า primer dimer เยอะมากด้วยก็น่าจะเป็นเพราะ condition ที่ใช้ยังไม่ optimum ซึ่งก็จะอธิบายได้ด้วยว่าทำไมจึงไม่ได้ product ทุกราย ถ้าเป็นแบบนี้ก็ต้องลอง optimise ดูใหม่ด้วยการปรับเปลี่ยนความเข้มข้นของ Mg++, annealing temperature

สำหรับการคำนวณ condition นั้นเราทำเองยากค่ะ เพราะมีหลายปัจจัยที่เกี่ยวข้องในการคำนวณ เพราะเดี๋ยวนี้เขาสามารถจะ simulate reaction จาก primer sequence ได้ด้วยคอมพิวเตอร์กันแล้วค่ะ มี free software มากมายให้เลือกใช้นะคะ ลองเช็ค primer ที่ใช้อยู่กับโปรแกรมพวกนั้นดูก็ได้ค่ะ (ลองอ่านบันทึกนี้ตั้งแต่ต้น แล้วก็ตามลิงค์ไปอ่านรายละเอียดดูนะคะ คงจะช่วยให้คิดหาวิธีแก้ปัญหาได้มากขึ้น)

ได้แก้ปัญหาเยอะๆแบบนี้ถือเป็นโชคดีนะคะ ได้เรียนรู้วิธีการลองผิดลองถูกด้วย  พี่โอ๋ว่า PCR นี่เป็นทั้งศาสตร์และศิลป์จริงๆค่ะ ขอให้โชคดีนะคะ

son
IP: xxx.42.82.139
เขียนเมื่อ Tue Jan 06 2009 21:48:57 GMT+0700 (ICT)

สวัสดีค่ะ

หายไปนานเลย หนูมีเรื่องจะรบกวนถามอาจารย์อีกแล้วค่ะ

หนูทำ real time มีขนาด fragment ค่อนข้างใหญ่คือ 1.7 กับ 1.5 kb ซึ่งหนูลองใช้ PCR product จากการทำ conventional PCR มาลองทำดูเพื่อหาตำแหน่ง melting curve ของ peak ในการ amp product ขนาด 1.7 kb ซึ่งเมื่อนำมา run gel ก็พบ band ตามที่ต้องการ พอดู peak ก็ได้ตำแหน่ง ประมาณ 76 องศา ก็เลยลง real time โดยใช้ PCR product พร้อมกับ genomic DNA เที่ยบกัน โดยใช้สี Syto 9 green พอทำออกมาแล้วพบว่่าในตัวอย่างที่เป็น genomic DNA กลับ amplified ไม่ได้ ซึ่งหนูก็ลองเพิ่ม additive , enzyme แล้วก็ไม่ได้ช่วยอะไร หนูควรจะแก้ปัญหานี้อย่างไรดีค่ะ

ขอบคุณค่ะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Tue Jan 06 2009 23:27:54 GMT+0700 (ICT)

หนู son คะ ต้องขอบอกว่าไม่ค่อยแน่ใจว่าเข้าใจคำถามหนูถูกไหมนะคะ ขอให้หนูช่วยเขียนขั้นตอนการทดลองของหนูตามลำดับที่ทำจริงๆให้ละเอียดขึ้นอีกนิดนะคะ อ่านแล้วยังค่อนข้าง งง อยู่ค่ะ

son
IP: xxx.7.138.27
เขียนเมื่อ Thu Jan 08 2009 22:52:29 GMT+0700 (ICT)

- หนูใช้ sample ที่เป็น PCR product จากการทำ conventional PCR มาลองทำ real time เพื่อหาตำแหน่งของ melt peak ซึ่งหนูทำ real time โดยมีขนาด fragment 1.7 kb ใช้สี Syto 9 green

- พบ peak ที่ประมาณ 76 องศาโดยพบทั้งในราย positive และ negative ซึ่งจริงๆแล้วมันควรจะขึ้นแต่ในรายที่ positive เพราะ band ที่ได้จากการ run gel ก็เป็น positive band แสดงว่ามันยังไม่ specific ใช่มั้ยค่ะ (ในราย positive melt peak สูงมาก)

- ทำ real time โดยใช้ sample tube หนึ่งเป็น PCR product อีก tube เป็น genomic DNA ผลออกมาพบว่า amplified ได้เฉพาะใน sample ที่เป็น PCR product หนูจึงอยากทราบว่าจะมีวิธีอะไรที่จะช่วยให้ amplified fragment ขนาดใหญ่ในการทำ real time PCR

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Thu Jan 08 2009 23:43:07 GMT+0700 (ICT)

ถ้าเห็น peak ทั้งในราย neg และ pos แล้วแถมมี melting temperature แค่ 76 นี่น่าจะไม่ใช่ product ที่เราตรวจสอบใน gel นะคะ เพราะพวกที่เป็น product จริงๆน่าจะมี melt peak ที่อุณหภูมิสูงกว่านี้ค่ะ (น่าจะเกิน 80 องศาขึ้นไปน่ะค่ะ)

เพราะฉะนั้น product ที่เราเห็นว่า amp ได้นี่อาจจะไม่ใช่ที่เราต้องการก็ได้นะคะ เพียงแต่จาก PCR product นั้นตัวมันเองมีการ incoporate dye เข้าไปให้เรา detect ได้ด้วยเครื่องเท่านั้นเอง

พี่โอ๋ลอง search ดูคร่าวๆพบว่า product ขนาดยักษ์ๆที่ใช้ real-time PCR method ทำก็พอมีนะคะ อย่างที่ http://www.epibio.com/pdfforum/11_4_17-19.pdf เขาได้ product 1.3 kb แต่เห็นมีปัญหาว่า ต้อง titrate หาความเข้มข้น template กับปรับ cycling time

ปกติเขาแนะนำ product size ที่เหมาะกับการใช้ real-time PCR ไว้ไม่เกิน 4-500 bp น่ะค่ะ ก็เลยไม่แน่ใจว่าจะ work ไหมกับ product ใหญ่ขนาดนี้

หนูอาจจะต้องปรับ condition ให้ได้ product จริงๆหลายรอบหน่อยนะคะ ไว้พี่โอ๋หาแหล่งที่จะถามเรื่องนี้ได้แล้วจะมาบอกเพิ่มเติมนะคะ ปัญหานี้น่าจะต้องถามพวก forum ต่างๆที่เขาทำ real-time ดูค่ะ พี่โอ๋ห่างหายจากวงการเขามานาน สงสัยต้องใช้เวลาตามหากันหน่อยนะคะ

son
IP: xxx.12.97.100
เขียนเมื่อ Sat Jan 10 2009 15:06:11 GMT+0700 (ICT)

ขอบคุณมากนะคะที่ช่วยหาข้อมูลให้

พอดีหนูลองใช้ condition นี้ในการทำ conventional PCR แล้วมัน amplified ได้ดี ก็เลยลองเอามาทำ real time PCR ซึ่งพอทำแล้วกลับไม่ได้ผลดีเหมือนทำในconventional PCR หนูก็เลยลองปรับหลายอย่างแต่มันก็ไม่ได้ผล แต่เดี๋ยวคงจะต้องไปลองปรับเหมือนที่อาจารย์บอกคะ

kaiau
IP: xxx.147.39.17
เขียนเมื่อ Thu Apr 23 2009 18:04:29 GMT+0700 (ICT)

อยากสอบถามนิดนึงค่ะ คือว่าทำ PCR แล้วพอนำ pcr product มารัน agarose gel ดูพบว่าเกิด เป็น smear ค่ะ แต่ว่าพบ single band ที่ตรงกับ size ยีนที่ต้องการ นะคะ แล้วก็มี primer dimer ค่อนข้างเยอะค่ะ ลองนำ template มาเช็คดูแล้วยังใช้ได้ค่ะ จะแก้ไขปัญหายังไงดีคะ หรือว่าสภาวะยังไม่เหมาะสม ขอบคุณล่วงหน้าค่ะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Thu Apr 23 2009 21:36:13 GMT+0700 (ICT)

ปัญหาแบบนี้มีคนเจอเหมือนกันค่ะ ลองอ่านดูที่นี่นะคะ มีคนแก้หลายแบบค่ะ อ่านดูว่าอันไหนเข้าเค้ากับของเราก็ลองปรับดูนะคะ เป็น forum ที่เขาเอาปัญหาการทำ PCR มาแลกเปลี่ยนบอกเล่ากันน่ะค่ะ

palmolive
IP: xxx.157.232.6
เขียนเมื่อ Tue May 12 2009 21:38:18 GMT+0700 (ICT)

คือหนุทำ pcr แยกแบคทีเรียจากฟองน้ำค่ะเมื่อผลออกมาไม่แน่ใจว่ามัน primer-dimer หรือป่าวอยากทราบว่า primer-dimer ที่เกิดขึ้นประมาณกี่ bp ค่ะ

แล้วจะแก้ปัญหานี้ได้อย่างไรค่ะ

และเป็นไปได้ไหมค่ะว่าแบคทีเรียที่ต่างชนิดกันที่มาจากฟองน้ำต่างชนิดและชนิดเดียวกันแล้วมีแบน pcr ขึ้นขนาดเดียวกันได้ค่ะ

som
IP: xxx.123.218.159
เขียนเมื่อ Tue May 19 2009 21:38:29 GMT+0700 (ICT)

หนูสกัด RNA ด้วย trizol แล้วก็เปลี่ยนเป็น cDNA เพื่อไปทำ PCR หนูทำยีน beta actin แต่ทำแล้วบางทีก็ขึ้น บางทีก็ไม่ขึ้น เช่น ทำ 8 ตัวอย่าง ขึ้น 6 หาย 2 ทั้งที่แน่ใจว่าได้ใส่ template ไปแล้วแน่นอน ช่วยให้คำปรึกษาหนูหน่อยครับ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Tue May 19 2009 23:29:11 GMT+0700 (ICT)

ตอบคำถามหนู palmolive [IP: 124.157.232.6] ก่อนนะคะ

หนูคงต้องเอา primers ของหนูเช็คที่ BLAST ว่า product ที่ได้เป็นแบคทีเรียที่หนูต้องการหรือเปล่าและมีขนาดเท่าไหร่บ้างก่อนนะคะ จากผลของ BLAST ก็จะได้ทราบว่ามี product อะไรอื่นๆที่อาจจะเป็น primer-dimer ได้ด้วยค่ะ พวกที่มีเปอร์เซ็นต์ similarity ต่ำๆน่ะค่ะ ก็พอดูได้ว่ามีขนาดสักเท่าไหร่บ้าง 

การแก้ปัญหา primer-dimer ก็ต้องทำการ optimize PCR reaction จนกว่าจะสามารถกำจัดมันได้น่ะค่ะ ทำได้หลายวิธี อาจจะลองเพิ่มลดอุณหภูมิที่ใช้ annealing, ปรับความเข้มข้นของ Mg, primers หรือ template ลองทีละอย่างไปเรื่อยๆจนกว่าจะได้เฉพาะ product ที่เราต้องการ

"แบคทีเรียที่ต่างชนิดกันที่มาจากฟองน้ำต่างชนิดและชนิดเดียวกันแล้วมีแบน pcr ขึ้นขนาดเดียวกัน" เป็นไปได้ค่ะ ตรวจสอบได้จากผล BLAST นั่นแหละนะคะ  

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Tue May 19 2009 23:40:30 GMT+0700 (ICT)

ส่วนคำถามของน้อง  som [IP: 222.123.218.159] นั้น เหตุผลที่อาจเป็นไปได้น่าจะอยู่ที่คุณภาพของ RNA ที่ได้จาก trizol  น่ะค่ะ ที่เคยทำจะใช้วิธี run RNA gel เช็คคุณภาพดูอีกทีก่อนค่ะ ซึ่งการที่เราต้อง amplify Beta actin เป็น control ก็เพราะอย่างนี้แหละค่ะ

som
IP: xxx.142.204.1
เขียนเมื่อ Wed May 20 2009 11:33:56 GMT+0700 (ICT)

หนูเอา RNA ไปวัดความเข้มข้นก่อนจะเอามา แปลงเป็น cDNA แล้วนะคะ ซึ่งความเข้มข้นของ RNA ก็อยู่ในเกณฑ์ที่ยอมรับได้นะคะ และที่แบนไม่ขึ้นพี่คิดว่าเป็นเพราะ RNA ไม่ม่คุณภาพเหรอคะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Wed May 20 2009 21:27:42 GMT+0700 (ICT)

หนู som วัด RNA ด้วยวิธีไหนคะ ถ้าด้วยการวัด OD เฉยๆจะไม่สามารถบอกคุณภาพได้ค่ะ ได้แต่ปริมาณเท่านั้น และการสกัดด้วยวิธีของ Trizol อาจมี contaminate ที่ทำให้ได้ค่า OD260 สูงกว่าจริง (เหมือนว่ามี RNA มากแต่ที่จริงไม่ใช่) ได้ด้วยค่ะ การ run gel จะช่วยให้เราเห็นว่า RNA ที่ได้สมบูรณ์หรือ degrade ได้ด้วยค่ะ เพราะ RNA ที่มีปริมาณโอเคแต่ degrade ก็จะทำ RT แล้วได้ cDNA ที่ไม่สมบูรณ์ซึ่งทำให้เรา amplify beta actin ได้บ้างไม่ได้บ้างได้ค่ะ

IP: xxx.90.13.192
เขียนเมื่อ Fri Jun 12 2009 23:51:17 GMT+0700 (ICT)

สวัสดีค่ะ อาจารย์

หนูกำลังแปลบทความภาษาอังกฤษเกี่ยวกับ Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR) และ (SON-PCR) Single oligonucleotide nested PCR แต่หนูมีความรู้แค่พื้นฐานPCRเท่านั้นเองค่ะ

หนูอยากรู้หลักการของPCRทั้งสองแบบและความแตกต่างจากPCRธรรมดาค่ะ

รบกวนอ.ด้วยนะค่ะ เพราะหนูลองหาเองแล้วยังไงก็ไม่เจอเลยค่ะ

IP: xxx.47.232.126
เขียนเมื่อ Sun Aug 02 2009 09:48:15 GMT+0700 (ICT)

อาจารย์คะ หนูทำ PCR บนตำแหน่ง D1S80 ค่ะ ซึ่งตามทฤษฎีเนี้ยมันต้องเกิด 1 หรือ 2 band หลังจากที่มา run บน agarose gel ใช่ไหมคะ แต่ที่พบปัญหา คือ พบว่าบน gel กลับพบ 3 band เลยอยากถามว่ามันเกิดจาก non specific primer หรือป่าว หรือเกิดจาก contaminate ในระหว่างที่สกัด DNA คะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Sun Aug 02 2009 14:11:19 GMT+0700 (ICT)

ขอโทษสำหรับหนู ไม่แสดงตน [IP: 61.90.13.192] ด้วยนะคะที่เพิ่งเข้ามาเห็นคำถาม ถ้ายังติดตามอยู่ จะขอให้ส่งสิ่งที่หนูแปลมาให้ดูหน่อยนะคะ ที่อีเมลติดต่อ น่ะค่ะ แล้วจะได้ช่วยบอกความแตกต่างให้ค่ะ ในส่วนของคำอธิบายภาษาอังกฤษหาได้หลายแหล่งมากค่ะ หนูคงมีอยู่แล้ว

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Sun Aug 02 2009 14:15:40 GMT+0700 (ICT)

ส่วนหนู ไม่แสดงตน [IP: 117.47.232.126] ต้องพิจารณาหลายขั้นตอนค่ะ เริ่มตั้งแต่ว่า หนูใช้ primer ตัวไหน sequence เป็นอย่างไร ลอง BLAST เช็ค product ดูก่อนหรือยังว่า ได้เป็นอะไรมาบ้าง ส่วน band ที่หนูได้มา 3 band นั้นมีขนาดตรงกับที่เขาบอกไว้ด้วยหรือเปล่า condition ที่ใช้ตรงกับเขาหรือไม่ ถึงจะตอบคำถามที่หนูสงสัยได้ค่ะ

OOM
IP: xxx.12.97.115
เขียนเมื่อ Mon Oct 12 2009 11:22:55 GMT+0700 (ICT)

สวัสดีค่ะ

ตอนนี้กำลังจะออกแบบ specific primer อยากทราบหลักการออกแบบ primer โดยไม่ใช้โปรแกรมคอมพิวเตอร์ (manual) ว่ามีวิธีการและหลักการอย่างไรค่ะ ขอบคุณมากค่ะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Fri Oct 16 2009 16:28:39 GMT+0700 (ICT)

เห็นคำถามของคุณ OOM [IP: 202.12.97.115]แล้ว สงสัยว่าทำไมถึงอยากออกแบบเองคะ ต้องคำนึงถึงอะไรหลายอย่างมากเลยค่ะ ลองอ่านดูได้ที่ http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html เราเช็คได้ไม่ถ้วนถี่แน่นอนเลยค่ะ แถมถ้าสั่งมาลอง optimise เองด้วยยิ่งงานหนักโดยไม่จำเป็นเลยค่ะ ยังไงก็ต้องใช้พวก โปรแกรมต่างๆในการตวจสอบคุณสมบัติของ primers ที่เราออกแบบอยู่ดีค่ะ

benz
IP: xxx.27.226.116
เขียนเมื่อ Sat Nov 21 2009 20:14:24 GMT+0700 (ICT)

รบกวนอาจารย์หน่อยครับพอดีผมทำโปรเจคเกี่ยวกับbioinformatic โดยทำหัวข้อจะหา genetic marker ที่เหมาะสมในการวินิจฉัยเชื้อ infruenza virus ด้วนเทคนิค multiplex pcr ตอนนี้ผมไม่ค่อยมีความรุ้ด้านโมเลกุลาเลยครับอยากให้อาจารย์ช่วยเเนะนำด้วยครับเเล้วก็ตอนนี้ผมอยากได้หลักการเทคนิค multiplex pcr รบกวนอาจารย์ช่วยลงให้หน่อยนะครับขอเป็นภาษาไทยนะครับ

ตอนนี้อ่านเปเปอก็ไม่รุเรื่งเลยครับเพราะอ่อนภาษาอังกฤษมากๆ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Wed Nov 25 2009 23:32:01 GMT+0700 (ICT)

สวัสดีค่ะ คุณ benz [IP: 125.27.226.116] เขียนได้น่ารักน่าช่วยมากเลยค่ะ แต่ว่าหัวข้อ multiplex PCR ก็ไม่ง่ายที่จะอธิบายกันได้ในระยะเวลาหรือบทเรียนสั้นๆหรอกนะคะ ในเวลาอันสั้นที่ต้องการความรู้เรื่องนี้ แนะนำให้หา review paper ที่เกี่ยวกับเรื่องนี้อ่านดูนะคะ แต่ยังไงๆก็คงต้องพยายามแกะภาษาอังกฤษให้ได้อยู่ดีค่ะ

เวลาอ่าน paper ก็ให้สแกนดูกว้างๆก่อน ไม่ต้องอ่านหมดทุกตัวอักษร รู้จักดู keywords มองหาประโยคแต่ละประโยค แล้วคิดแบบรวมๆอย่าแปลเป็นคำๆ ลองพยายามดูนะคะ ยังไงๆเรียนสาขานี้แล้ว เลี่ยงข้อมูลภาษาอังกฤษไม่ได้แน่ๆค่ะ ก็ต้องลุยและหาวิธีอ่านให้เป็นดีกว่านะคะ

ถ้าอยากให้ช่วย อาจจะส่งเปเปอร์ที่อ่านแล้วไม่เข้าใจมาถามทางอีเมล อีเมลติดต่อ ดูนะคะ

สาธิต รอดภักดีกุล
IP: xxx.200.98.97
เขียนเมื่อ Tue Jan 05 2010 15:27:36 GMT+0700 (ICT)

ขอเรียนสอบถามอาจารย์ครับ เกี่วกับการใช้ synthetic primer ครับ

เนื่องจากในใบรายละเอียดของไพรเมอร์เขาจะบอกผล gel electrophoresis และ identification ต่างๆ

ด้วยความเข้าใจผิดของผมเอง ทำให้หลังจากอ่านจบแล้ว ผมละลายไพรเมอร์ที่ lyophilized มาแล้ว ด้วย 1xTBE buffer ครับ ซึ่งที่จริงแล้วต้องเป็น 1xTE buffer ครับ

ไม่ทราบว่า boric acid จะ interfere stability ของ primer's stock solution และของ PCR reaction หรือไม่ครับ

ปล. stock solution ของ lyophilized synthetic primer เข้มข้น 100 uM (ละลายใน 1x TBE buffer ~ 450 ul)

ความเข้มข้นก่อนใช้ (start concentration = 10 uM dilute ด้วย dd water)

ความเข้มข้นที่ใช้ใน PCR reaction = 0.4 uM ครับ

รบกวนอาจารย์ด้วยครับ

ขอบพระคุณมากครับ

สาธิต

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Tue Jan 05 2010 17:06:19 GMT+0700 (ICT)

ตอบคุณสาธิต รอดภักดีกุล คร่าวๆก่อนนะคะ ยังไม่ได้ยืนยันจากตำราที่ไหนถ้ามีเวลาน่าจะต้องหาดูจากพวก basic text อีกทีนะคะ

ปกติ TBE buffer เขาใช้กับ electrophoresis เพราะ boric มันมี buffer capacity ดีกว่า TE buffer และมีฤทธิ์เป็น antiseptic ด้วยก็ช่วยให้ buffer ไม่ con ได้ด้วย

จำได้ว่าตัวเองก็เคยใช้ TBE ละลาย stock primers นะคะ ก็เวิร์คดีไม่มีปัญหาค่ะ

สาธิต
IP: xxx.200.98.97
เขียนเมื่อ Tue Jan 05 2010 17:36:49 GMT+0700 (ICT)

เฮ้ออ.. โล่งอกไปทีครับอาจารย์ เดี๋ยวผมกำลังจะนำ PCR product ไปรันเจล อีกสักแปบจะทราบผล ขอบคุณอาจารย์มากครับ กำลังเครียดกลัวถูกด่า 55 ผมคงจำไปนานเลยครับ - - "

IP: xxx.108.144.147
เขียนเมื่อ Mon Apr 19 2010 11:59:43 GMT+0700 (ICT)

เรียนถามอาจารย์ค่ะ

เนื่องจากตอนนี้กำลังหาข้อมูลของ primer ที่ได้ลำดับจากนิวคลีโอไทด์ของ internal transcribed spacer (ITS) ITS4/ITS5

อยากทราบว่า primer พวก ITS นี้มีความจำเพาะต่อเชื้อ (ตอนนี้ทำ thesis เกี่ยวกับเชื้อราอยู่ค่ะ) มากขนาดไหน เพราะเห็นว่านำมาใช้กับหลายเชื้อมาก รบกวนอาจารย์ช่วยลงหน่อยนะคะ เพราะว่าความรู้ด้านนี้น้อยมากแล้วก็ paper ที่หามาอ่านแล้วยังไม่ค่อยเข้าใจได้ลึกซึ้งเท่าไหร่ค่ะ

ขอบคุณมากค่ะ

กุ๊กกิ๊ก
IP: xxx.157.145.115
เขียนเมื่อ Thu Apr 29 2010 01:41:58 GMT+0700 (ICT)

สวัสดีค่ะ รบกวนเรียนขอคำแนะนำค่ะ อาจารณ์

หนูกำลังทำโปรเจคเกี่ยวกับไวรัสพืช ซึ่งตอนนี้กำลังศึกษาถึงขั้นตอน PCR และได้พบปัญหาคือ หลังจาก ทำPCR แล้ว ได้bandที่เข้ม ชัด และขนาดตามต้องการ แต่เมื่อนำ PCR Product มาทำPCR อีกครั้งเพื่อตรวจสอบและเพิ่มปริมาณให้มากกว่าเดิม ผลเป็น Sear band ซึ่งไม่ได้bandดังเช่นทำPCRครั้งแรก หนูจึงอยากจะทราบสาเหตุท่ี่ทำไห้เกิด Sear band และควรแก้ปัญหาตรงนี้ยังไงค่ะ

ขอบพระคุณมากค่ะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Sun May 02 2010 14:01:40 GMT+0700 (ICT)

ต้องขอโทษที่เข้ามาตอบช้าไปหน่อยนะคะ สำหรับคำถามของคุณ ไม่แสดงตน [IP: 158.108.144.147] ทำให้ได้ไปหาคำตอบให้ พบว่า PCR นี่มีประโยชน์มากจริงๆนะคะ วิทยาการก้าวหน้าจนอีกหน่อยเราคงวินิจฉัยเชื้อโรคกันได้จำเพาะและรวดเร็วขึ้นเยอะ สำหรับเจ้า  internal transcribed spacer (ITS) นี่มี review น่าสนใจอยู่ที่ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11860017 ใน Med Mycol. 2002 Feb;40(1):87-109.นะคะ ถ้าอ่านแล้วไม่ค่อยใจตรงไหนค่อยถามเข้ามาอีกทีนะคะ

 

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Sun May 02 2010 14:10:53 GMT+0700 (ICT)

สำหรับคุณ กุ๊กกิ๊ก [IP: 124.157.145.115] คำถามที่ถามถึง sear band นั้นหมายถึง smear band ใช่ไหมคะ การนำ PCR product มาทำ PCR อีกครั้งนั้น หนูเอามายังไงคะ ตัดจาก gel หรือเปล่า purify หรือยัง ต้องลองตรวจสอบขั้นตอนพวกนี้ดูว่าทำได้ถูกต้องไหมน่ะค่ะ เพราะโอกาสที่เราจะทำผิดพลาดมีได้หลายอย่างมาก ที่จะทำให้ผลในลำดับต่อมาไม่เป็นอย่างที่คาด

หลิว
IP: xxx.157.251.215
เขียนเมื่อ Sun May 02 2010 22:06:17 GMT+0700 (ICT)

หนูอยากถามว่า ในการทำ PCR internal control มีประโยชน์อะไรคะ แร้วทำมัยมีแบนด์เกิดขึ้น

เจ
IP: xxx.108.144.147
เขียนเมื่อ Mon May 03 2010 10:15:38 GMT+0700 (ICT)

ขอบคุณมากๆค่ะ สำหรับคำตอบ จะเข้าไปหาข้อมูลตาม website ที่ link มาให้นะคะ

IP: xxx.157.149.160
เขียนเมื่อ Thu May 06 2010 02:05:16 GMT+0700 (ICT)

ขอบพระคุณมากค่ะอ, สำหรับคำแนะนำ

แต่ อ.ค่ะ จากคำถามของหนูข้างต้น ที่อ.บอกว่า '"หนูเอามายังไงคะ ตัดจาก gel หรือเปล่า purify หรือยัง " หนูยังไม่สามารถทำในขั้นตอนดังกล่าวได้ เนื่องด้วยหนูเกิดปัญหา smear band ขึ้น เพราะจาการทำ PCR ครั้งแรกของหนู ได้ ปริมาณ DNA น้อยมาก(จาง)

หนูก็เลยนำPCR product ในการทำPCRครั้งแรก มาทำPCRครั้งที่2อีก โดยใช้แทน c DNA ผลคือ เกิด smear band ค่ะ เป็นไปได้ไหมค่ะว่า primer ที่ใช้เป็น non specific primer ถ้าเป็นnon specific primer หนูไม่เข้ากลไกลของมันค่ะว่า ทำไมการที่เป็นnon specific primer ถึงทำให้เกิดsmear band

ขอบพระคุณมากค่ะ อ.

IP: xxx.157.149.160
เขียนเมื่อ Thu May 06 2010 02:11:04 GMT+0700 (ICT)

เรียนขอคำปรึกษา อีคำถามค่ะ อ.

คือ หนูอยากทราบถึงกลไกลการทำงานของ IPTG และ x -GAl ที่ใช้ในขั้นตอนการ Clon gene ค่ะ หนูอ่านหนังสือไปก้อไม่ค่อยเข้าใจเท่าไหร่ จึงขอรบกวนช่วยอธิบายไห้หนูหน่อยน่ะค่ะ

ขอบพระคุณอย่างสูงค่ะ

IP: xxx.157.149.160
เขียนเมื่อ Thu May 06 2010 02:57:54 GMT+0700 (ICT)

รบกวนอีกสักครั้งค่ะ อ.ค่ะ

ในขั้นตอนการทำ PCR จำเปนมั้ยค่ะว่าต้องเติมสารตัวไหนอันดับเเรก จนถึงสุดท้าย

เพื่ออะไรค่ะ

ขอบพระคุณค่ะ

งุงิ
IP: xxx.12.97.122
เขียนเมื่อ Thu May 20 2010 17:57:09 GMT+0700 (ICT)

ถึงคุณไม่แสดงตน งุงิก็เจอปัญหาที่ว่าได้ smear band จากการเอา pcr product ครั้งแรกมาทำ pcr อีกรอบเหมือนกัน แต่ว่า primer ที่ใช้เป็น specific primer เลยนะคะ ไม่ทราบว่าตอนนี้คุณแสดงตนทำสำเร็จหรือยังคะ แล้วก็ขอความช่วยเหลือจากอาจารย์ด้วยค่ะไม่ทราบว่าจะแก้ปัญหาได้อย่างไร เพราะว่าลองทำมาสองสามรอบแล้วก็ได้ smear band เหมือนเดิมค่ะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Thu May 20 2010 22:54:04 GMT+0700 (ICT)

คำถามของหนูหลิว [IP: 124.157.251.215]นี่ กว้างไปนิดนะคะ ตอบได้แบบกว้างๆว่า internal control ก็แปลว่าตัวควบคุมภายใน ให้รู้ว่าปฏิกิริยาของเรามันเวิร์คน่ะค่ะ ซึ่งทำอะไรเราก็ต้องหาวิธีตรวจสอบใช่ไหมคะว่า สิ่งที่เราทำนั้น ถ้าผลเป็นลบก็ลบจริงๆไม่ใช่น้ำยาหรือเอนไซม์หรือส่วนประกอบไหนไม่เวิร์ค ถ้าเป็นบวกก็บวกจริงๆ ไม่ใช่อะไร contaminate มา เพราะฉะนั้น internal control ของแต่ละบริบทของ PCR ก็มีความสำคัญต่างๆกันไป แต่หลักๆก็คือเอาไว้ตรวจสอบกระบวนการทำของเรานั่นเองค่ะ

น้องซิลเวีย
เขียนเมื่อ Thu May 20 2010 23:03:08 GMT+0700 (ICT)

สวัสดีค่ะอาจารย์

เทอมหน้าน้องซิลเวียมีแล็บ RT-PCR ของ iNOS และ COX-2 ค่ะ

ถ้ามีปัญหาในการทำ..หนูจะขอปรึกษาอาจารย์ค่ะ (จองไว้ก่อนค่ะ)

ขอบคุณค่ะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Thu May 20 2010 23:11:09 GMT+0700 (ICT)

หนูกุ๊กกิ๊ก ไม่แสดงตน [IP: 124.157.149.160] ใช้คอมหลายที่เหรอคะ เห็นคนละ IP กับของเดิม

สันนิษฐานจากที่หนูเล่ามา น่าจะเป็นปัญหาจากการที่ reaction ตั้งแต่แรกของหนูยัง optimize ไม่ดีพอทำให้ไม่ได้ product ที่ต้องการจริงๆ แบบนี้หนูจะเอาไปเพิ่มจำนวนต่อก็อาจไม่ใช่ product ที่หนูต้องการจริงๆ เพราะฉะนั้นหนูต้องเริ่มต้นทำต้นฉบับให้ดีๆก่อนถึงจะไปคัดเลือกทีหลังค่ะ จัดการ optimize ให้ได้ band สวยๆเสียก่อน ซึ่งก็ต้องปรับกันหลายอย่างหน่อย ลองเข้าไปอ่านดูที่ http://biowww.net/detail-21.html เขามีคนมาช่วยกันตอบเกี่ยวกับว่าทำยังไงจึงจะแก้ปัญหา smear band ที่ว่านี้ มีหลายวิธีค่ะ อ่านดูว่าของเราใกล้เคียงอันไหน แล้วลองปรับใช้ดูนะคะ

กับอีก forum นึงที่ ใช้ได้สำหรับหนูงุงิ [IP: 202.12.97.122] ด้วยค่ะ

ชักสงสัยว่าหนูทั้งสองอาจมีปัญหากับการ optimize ปฏิกิริยาตั้งต้นนะคะ ถ้าจะให้ช่วยวิเคราะห์ปัญหาให้ หนูส่ง condition ที่ใช้และรายละเอียดในการทำ PCR ขั้นแรกที่ทำมาให้อีกทีนะคะ อาจจะชี้ปัญหาได้ชัดขึ้น

สำหรับใส่อะไรก่อนหลังนี่ก็ขึ้นกับว่าตัวไหนใส่ไปเพื่ออะไรน่ะค่ะ หนูต้องทำความเข้าใจกับปฏิกิริยาของ PCR ให้ดีว่าสารตัวไหนใส่ไปเพื่ออะไร condition ไหนตั้งแบบนั้นทำไม ขอรายละเอียดของปฏิกิริยาของหนูมาให้แล้ว อาจจะได้อธิบายได้ตรงจุดกว่านะคะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Thu May 20 2010 23:15:31 GMT+0700 (ICT)

คำตอบเมื่อกี๊ลืมใส่ลิงค์ให้ค่ะ ที่ http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/3542.html ของฝรั่งเขามา forum แลกเปลี่ยนปัญหาการทำ PCR หลายๆที่ถ้าขยันอ่านหน่อยก็อาจได้วิธีแก้ปัญหาของเราได้นะคะ คนตอบส่วนมากก็พวกเทพๆในเรื่อง PCR ทั้งนั้นค่ะ คนที่เคยเจอปัญหาแบบเดียวกับเราแล้วแก้ได้มาแล้วมีเยอะแยะค่ะ บางปัญหาก็มีวิธีแก้หลายแบบ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Thu May 20 2010 23:30:54 GMT+0700 (ICT)

สำหรับคำถามที่ว่า "กลไกลการทำงานของ IPTG และ x -GAl ที่ใช้ในขั้นตอนการ Clon gene" นั้น หนูพิมพ์ผิด 2 ที่นะคะ (ไม่รู้ผิดเพราะเข้าใจผิดหรือพิมพ์ผิด ขอแก้ให้ด้วยละกันนะคะ "กลไก" และ Clone gene ถึงจะถูกนะคะ)

คำอธิบายที่ ใบแนบน้ำยาของบริษัท Sigma ที่ http://www.sigmaaldrich.com.cn/etc/medialib/docs/Sigma/Instructions/media_supplements.pdf  เขาบอกชัดเจนแปลได้ไม่ยากนะคะ หนูลองอ่านตรงที่ขีดเส้นใต้แดงดูนะคะ

b-D-galactopyranoside

(X-Gal; BCIG; 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl b-D-galactoside)

CAS No. 7240-90-6

C14H15BrClNO6 FW 408.6

X-Gal is a chromogenic substrate for b-galactosidase that produces a rich blue color that can easily be detected visually over background. X-Gal is a substrate for bluewhite selection of recombinant bacterial colonies with the lac+ genotype.

 

IPTG

Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside

Non-metabolizable galactose analog. IPTG is commonly used in cloning procedures that require induction of b-galactosidase activity. It is used in conjunction with X-Gal or S-gal in blue-white selection of recombinant bacterial colonies that induce expression of the lac operon in Escherichia coli. IPTG functions by binding to the lacI repressor and altering its conformation, which prevents the repression of the b-galactosidase coding gene lacZ.

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Thu May 20 2010 23:36:35 GMT+0700 (ICT)

 น้องซิลเวีย ทำแล็บที่ไหนคะ ถ้าจะให้ดึผูกมิตรกับพวกพี่ๆเอาไว้ เพราะส่วนมากปัญหาก็มักจะวนเวียนซ้ำๆเดิมน่ะค่ะ สำหรับมือใหม่หัดขับทั้งหลาย แต่ยังไงก็ยินดีช่วยตอบค่ะ ไม่ต้องจองก็ได้ :-) (แต่อาจจะช้าๆ...บ้างแล้วแต่สถานการณ์ค่ะ เช่นครั้งนี้ถามต้นเดือนตอบเกือบปลายเดือนแน่ะ) 

งุงิ
IP: xxx.12.97.122
เขียนเมื่อ Sat May 22 2010 14:30:13 GMT+0700 (ICT)

ขอบคุณอาจารย์ค่ะ หนูจะลองเข้าไปอ่านตามลิงค์ที่ให้ไว้นะคะ

กุ๊กกิ๊ก
IP: xxx.157.148.179
เขียนเมื่อ Sat May 22 2010 22:58:53 GMT+0700 (ICT)

ขอพระคุณ อาจารย์ เป็นอย่างสูงน่ะค่ะ ที่ให้คำแนะนำ ทำให้หนูรู้อะไรหลายอย่างมากขึ้น

ขอบพระคุณมากจีงๆค่ะ

นู๋นิศารัตน์
IP: xxx.172.150.165
เขียนเมื่อ Sat Jun 12 2010 17:23:56 GMT+0700 (ICT)

lสวัสดีค่ะหนูขอรบกวนแปรประโยคนี้ให้หนู่หน่อยค่ะเป็นชื่อเรื่งในเปเปอร์นึงที่อ่านค่ะขอบคุณมากๆๆๆค่ะ

Optimizing the yield and utility of circulating cell-free DNA from plasma and serum

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Sat Jun 12 2010 22:14:41 GMT+0700 (ICT)

นู๋นิศารัตน์ [IP: 118.172.150.165] คะ ก่อนตอบต้องขอแก้ที่หนูเขียนหน่อยนะคะ อยากให้ช่วยกันเขียนภาษาเราให้ถูกๆดีกว่านะคะ หวังว่าหนูจะเขียนผิดเพราะพิมพ์เร็วไปมากกว่านะคะ

lสวัสดีค่ะหนูขอรบกวนแปรแปลประโยคนี้ให้หนู่หนูหน่อยค่ะเป็นชื่อเรื่งเรื่องในเปเปอร์นึงที่อ่านค่ะขอบคุณมากๆๆๆค่ะ

Optimizing the yield and utility of circulating cell-free DNA from plasma and serum

การปรับผลผลิตให้เหมาะสมและการใช้ circulating cell-free DNA (อันนี้แปลยากนะคะ มันคือDNA ที่ปราศจากเซลล์ซึ่งไหลเวียนอยู่ในเลือด) จากพลาสมาและซีรัม

 

arthsrn
เขียนเมื่อ Tue Jul 27 2010 16:27:37 GMT+0700 (ICT)

รบกวนหน่อยครับ พี่ๆคนไหนมีเปเปอร์ article อะไรเกี่ยวกับด้าน molecular เป็นพื้นฐานมี่จำเป็นในงานสายนี้ขอคำแนะนำด้วยครับ มือใหม่ครับ :))

มีคำถามด้วยครับ ITS มีข้อดีอย่างไรครับเห็นนิยมนำมาทำ phylogeny ในพืช แล้วแต่ละ ITS ต่างกันยังไงครับ? ขอบคุณครับ :))

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Tue Jul 27 2010 22:40:40 GMT+0700 (ICT)

คุณ arthsrn  คะ หาได้จาก Google ไม่ยากเลยค่ะ เอาไปหนึ่งตัวอย่างนะคะ ที่ http://www.springerlink.com/content/913m5cukvdqxbu9x/

arth
IP: xxx.200.121.78
เขียนเมื่อ Wed Jul 28 2010 21:49:05 GMT+0700 (ICT)

รบกวนอีกเรื่องครับ

ผมจะทำการ lyse เซลล์ ผมเคยใช้ lysis buffer ตามเปเปอร์นี้ครับ Rotureau, B., Gego, A., and Carme, B. 2005. Trypanosomatid protozoa: A simplified DNA isolation procedure. Experimental Parasitology 111:207-209

ซึ่ง yield ที่ได้ค่อนข้างดีทีเดียว ทีนี้จะนำมาใช้กับสาหร่ายสีเขียวที่เป็น Macroalgae (สาหร่ายที่เห็นได้ด้วยตาเปล่าเลย) ได้ไหมครับ? เป็น protist เหมือนกัน ผมไม่แน่ใจว่าจะใช้ด้วยกันได้ไหม

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Thu Jul 29 2010 00:17:21 GMT+0700 (ICT)

ต้องขอบอกว่าไม่มีความรู้เรื่องนี้เลยค่ะ ต้องใช้พี่ Google ด้วยความอยากรู้เหมือนกันน่ะค่ะ ก็พบว่า lysis buffer สำหรับ Macroalgae ที่ใช้ใน paper "Molecular Detection of Epiphytic Acaryochloris spp. on Marine Macroalgae" มีส่วนประกอบดังนี้ค่ะ 

lysis buffer (100 mM Tris-HCl [pH 8.0], 50 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% CTAB [cetyltrimethylammonium bromide])

 เมื่อเทียบกับ lysis buffer ใน paper ที่คุณ arth [IP: 161.200.121.78] ใช้อยู่คือ 

The lysis buffer was composed of 10 mM Tris–HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 0.5% SDS, 200 mM NaCl, and 100 μg/ml proteinase K. 

ก็ต่างกันตรง CTAB กับ proteinase K นั่นเอง ก็แสดงว่าคุณสมบัติโครงสร้างของเซลล์ของ Microalgae น่าจะต้องทำลายด้วย cationic detergent แทนที่จะเป็น proteinase K นะคะ

arthsrn
IP: xxx.200.121.78
เขียนเมื่อ Fri Jul 30 2010 01:26:03 GMT+0700 (ICT)

ขอบคุณมากเลยครับ อย่างนี้นี่เอง :)) เดี๋ยวจะลองคุยกับ sup ดูครับว่า ใช้ได้เหมือนกันไหม ><

Tikky
เขียนเมื่อ Sat Aug 21 2010 23:57:15 GMT+0700 (ICT)

อาจารย์คะ หนูทำPCR TB paper ที่เค้าทำกัน ถ้าให้ product 1 band แปลผลเป็น NTM , ถ้าให้ product 2 band แปลผลเป็น TB

ถ้าไม่มี band เลย แปลผลว่า Negative

หนูสงสัยว่าแล้วเราจะมั่นใจได้อย่างไรว่ามัน Neg จริง ไม่ใช่เราสกัดไม่ได้ product แล้วเราจะสามารถ design ให้มี band ควบคุมอีก 1 band ได้มั้ยคะว่า band นี้เป็นเหมือน QC ควบคุมว่าจะต้องขึ้นทั้งในคนที่นำมาตรวจ pcr ทุกคน

หนูเคยทำ thalassemia ก็จะมี band 1 band ที่ขึ้นในคนที่ปกติและในคนที่เป็นโรค

แต่อันนี้เป็นเชื้อ TB หนูเลยไม่รู้ว่าจะทำได้มั้ยคะ

เพราะอย่าง thalassemia คนเราทุกคนก็มี globin gene เหมือนกันแต่คนที่เป็น TB งงงงค่ะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Sun Aug 22 2010 00:15:41 GMT+0700 (ICT)

น้อง Tikky คะ ปกติแล้วไม่ว่าการทดสอบไหนๆก็จะต้องทำให้ทั้งระบบมีการควบคุมคุณภาพอยู่แล้วค่ะ ไม่งั้นก็ต้องเกิดคำถามแน่นอนอย่างที่หนูถามนี่แหละค่ะ ไม่ทราบว่าหนูพูดถึง paper ไหนคะ ช่วยบอกรายะเอียดหรือส่งลิงค์มาให้ด้วยนะคะ จะได้ช่วยไขข้อข้องใจให้หนูได้ค่ะ แต่เชื่อว่าต้องมีการตรวจสอบแน่นอนค่ะ อาจจะไม่ถูกต้อง 100% แต่ก็ต้องมี sensitivity และ specificity ที่สูงพอสมควรจึงจะนำมาใช้ได้จริง เพราะเราคงไม่นำการทดสอบที่มี false positive หรือ false negative มากๆมาใช้โดยไมีมีการควบคุมคุณภาพ เป็นหน้าที่ของพวกเรานักเทคนิคการแพทย์นี่แหละค่ะ ต้องทดสอบว่าวิธีการไหนจึงจะน่าเชื่อถือพอที่จะนำมาใช้กับตัวอย่างตรวจ

Atdhasit Aubonban
เขียนเมื่อ Mon Aug 23 2010 22:09:18 GMT+0700 (ICT)

สวัสดีครับอาจารย์ ผมก็มีคำถามแบบคุณ tikky ครับ ผมมีความคิดเห็นมาให้อาจารย์ช่วยพิจารณาให้หน่อยครับ

คือ ถ้าตัวอย่างตรวจ เราไม่สามารถรู้ได้ว่ามี DNA ที่เราสนใจ (ตัวอย่างจะเป็นพวก ชิ้นเนื้อ เสมหะ น้ำเจาะจากที่ต่างๆจากตัวผู้ป่วยที่หมอสงสัยว่าติดเชื้อ TB น่ะครับ ) เค้าก็ส่งมาตรวจ

แต่ว่า เราสามารถที่จะทำอย่างนี้ได้ไหมครับ คือก่อนทำการสกัด เราก็แยกตัวอย่างเป็นสองส่วน คือ ตัวอย่างปกติที่ได้มาแต่เดิม ส่วนอีกส่วนหนึ่งเราก้อเอาเชื้อที่เราผ่านการทดสอบแล้วยืนยันว่าเป็นเชื้อ TB จริง (เอามาจากที่เราเพาะเื้ชื้อ)มาใส่ แล้วทำให้กระจายตัว เมื่อเอามาทำจนเสร็จสิ้นการทดสอบแล้วจนถึงขั้นตอนอ่านผล ส่วนที่เราใส่เชื้อจากการเพาะเชื้อให้เป็น POSITIVE Control คือจะเกิดสอง Band ส่วนอีกส่วนที่เป็นของเดิม(ไม่ใส่เชื้อ)จากคนไข้

ถ้า ขึ้น 2 Band เป็น TB ,1Band เป็น NTM และถ้าไม่มี Band อ่านผลเป็นลบ ผมจะทำแบบนี้แล้วผลจะน่าเชื่อถือไหมครับ ถ้าหากอาจารย์มีวิธีไหนแนะนำก็แนะนำได้เลยนะครับ เพราะผมก็คิดอีกว่ามันเหมือนกับว่าผมต้องทำประกบทุกตัวอย่างเลยนะครับ ถ้ามี 20 ราย ผมก็ต้องทำเป็น 40

ขอขอบคุณอาจารย์มา ณ ที่นี้

นิศารัตน์
IP: xxx.172.132.171
เขียนเมื่อ Sat Aug 28 2010 20:34:47 GMT+0700 (ICT)

ขอบคุณมากๆๆค่ะอาจารย์

สงสัย
IP: xxx.88.114.58
เขียนเมื่อ Fri Oct 01 2010 13:05:37 GMT+0700 (ICT)

อยากถามว่าในขบวการ express protein ทำไม่ต้องนำไปโปรตีน sonicate ด้วยค่ะ แล้วก่อนที่จพนำมา run SDS-PAGE ทำไม่เราต้องต้มโปรตีนด้วยค่ะ แล้วถ้าเราจะ pure โปรตีนต่อ ทำไมเราต้องนำโปรตีนไป sonicate อีกค่ะ รบกวนด้วยนะค่ะสงสัยมากกกกก

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Fri Oct 01 2010 16:30:16 GMT+0700 (ICT)

ไอเดียของคุณ Atdhasit Aubonban นี่ดีนะคะ ก็น่าจะเป็นการเช็คได้เหมือนกัน ไม่แน่ใจว่าเขามีใช้กันหรือเปล่า หรือจริงๆเขาทำยังไงกัน ยังไม่มีเวลาค้นให้ แต่คิดว่าการ identify TB น่าจะก้าวหน้าไปมากแล้ว น่าจะมี reference ให้หาวิธีทำได้ไม่ยากนะคะ 

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Fri Oct 01 2010 16:46:07 GMT+0700 (ICT)

ส่วนคำถามของคุณ สงสัย [IP: 183.88.114.58] นี่ อยากจะขอให้ช่วยเขียนขั้นตอนมาให้หน่อยได้ไหมคะ จะได้อธิบายถูกว่าทำทำไม

แต่ถ้าจะให้บอกตามหลักการก็น่าจะเป็นเพราะต้องการแยกให้ได้ cell extract น่ะค่ะ การต้ม protein ก็เป็นการ denature protein นั่นเองค่ะ 

IP: xxx.11.27.159
เขียนเมื่อ Mon Oct 04 2010 13:04:21 GMT+0700 (ICT)

หนูอยากถามอาจารย์คะว่า ปิกติหนูทำpcrออกมา band เดียว แต่บังเอิญ ขึ้น2 band เกิดจากสาเหตุใดคะ แก้ไขอย่างไร

vee
IP: xxx.19.24.122
เขียนเมื่อ Sat Apr 16 2011 13:07:04 GMT+0700 (ICT)

เรียน อ.โอ๋

หนูได้อ่าน คำถามของ [IP:61.90.13.192]ตั้งแต่ 12 มิย.2552 สอบถามอ.ถึงหลักการ และความแตกต่างของ

Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR) และ (SON-PCR) Single oligonucleotide nested PCR ซึ่งหนูเอง

ก็มีความรู้เรื่อง PCR น้อยทั้ง ๆ ที่หน้าที่การงาน ก็ควรจะต้องรู้ จึงพยามหาอ่านข้อมูลไปเรื่อย แต่ถ้าเป็นภาษาอังกฤษ ก็อ่านได้ยากอีก แต่ก็พยาม หนูจึง อยากให้อ.อนุเคราะห์ด้วยค่ะ

vee

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Sat Apr 16 2011 16:57:55 GMT+0700 (ICT)

สำหรับคำถามจาก [IP: 58.11.27.159] เรื่องทำ PCR แล้วได้ 2 bands แทนที่จะเป็น band เดียวเหมือนปกตินั้น เราเองต้องตรวจสอบขั้นตอนการทำของเราก่อนนะคะ แล้วก็ส่วนผสมต่างๆ เพราะแต่ละส่วนประกอบในการทำ PCR มีโอกาสผิดพลาดได้มากอยู่แล้วค่ะ มีมากมายหลายปัจจัยซึ่งตอบได้ไม่หมดแน่ค่ะ ลองหาดูใน Google ด้วยคำว่า non-specific PCR products ดูนะคะจะเห็นมีหลายคำถามคำตอบเกี่ยวกับปัญหานี้ค่ะ

ส่วนคำถามและคำปรารภของน้อง vee ต้องขอโทษด้วยค่ะที่บางคำถามก็อาจจะกระโดดข้ามไปเพราะไม่รู้ลึกพอที่จะตอบ พอไม่มีเวลาไปหาก็อาจจะลืมตอบไปเลย แต่ก็พยายามตอบหรือช่วยหาคำตอบเท่าที่จะทำได้นะคะ

ก่อนจะพูดถึงเรื่องเทคนิคทั้งสองที่หนูถามมา ก็ต้องขอยืนยันว่า ยังไงๆเทคนิคด้านนี้ก็ยังมีข้อมูลเป็นภาษาอังกฤษมากมายกว่าภาษาอื่นๆ เพราะฉะนั้นเราก็คงเลี่ยงที่จะไม่ใช้ไม่อ่านภาษาอังกฤษไม่ได้ ก็ต้องพยายามฝึกอ่านเอาแต่เนื้อความไม่ต้องอ่านทั้งหมด ต้องรู้จักมองหาแต่สิ่งที่สำคัญๆในเรื่องที่เราต้องการรู้นะคะ ถ้ามีปัญหาในการอ่านบทความไหน ก็เขียนมาถามได้ค่ะ (ส่งลิงค์มาให้และบอกส่วนที่ต้องการให้ช่วยมาได้ แต่ยังไงๆก็ต้องลองพยายามดูเองก่อนด้วยนะคะ) 
สำหรับคำถาม "

หลักการ และความแตกต่างของ

Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR) และ (SON-PCR) Single oligonucleotide nested PCR" นั้น ถ้าเอาจากชื่อ เพราะเทคนิค PCR มันสามารถเอาไป modify ออกแบบที่จะให้ได้สิ่งที่เราต้องการมากมายหลายแบบ คนที่เขาคิดดัดแปลงก็ตั้งชื่อให้สื่อสารว่าเขาดัดแปลงยังไงนั่นเองค่ะ ถ้าเราเข้าใจศัพท์พื้นฐานก็น่าจะพอเดาได้ หนูส่งลิงค์ paper ที่อ่านไม่เข้าใจมาดูนะคะ พี่จะได้ยกเอาส่วนที่ควรอ่านมาให้ดูเป็นตัวอย่าง จะได้รู้วิธีอ่านเอาเรื่องว่าจะหาหลักการตรงไหน ความแตกต่างตรงไหน นะคะ

dar
IP: xxx.90.15.95
เขียนเมื่อ Sun May 01 2011 09:06:20 GMT+0700 (ICT)

เรียนปรึกษาอาจารย์ว่าทำไมเราเลือกใช้ GAPDH เป็น internal control gene for real time PCR คะ

ทำไมเราเลือก gene อื่น เช่น Beta 2 microglobulin เป็น internal control gene ล่ะคะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Mon May 02 2011 00:30:42 GMT+0700 (ICT)

การเลือก control gene ใน real-time PCR โดยใช้ gene ในกลุ่ม House-keeping genes ก็เพราะว่าเป็น gene ที่เรารู้ว่ามีแน่ๆในระบบต่างๆนั่นเองค่ะ แต่สำหรับ GAPDH นี่ต้องระวังหน่อยนะคะ เพราะเขามี gene ที่คล้ายกันมากๆอยู่ด้วย ต้องตรวจสอบดูให้แน่ๆด้วย BLAST ว่า primer ของเราจำเพาะกับ GAPDH จริงๆนะคะ

เพราะฉะนั้นหลักสำคัญจริงๆในการเลือก control ก็คือ ต้องเป็น gene ที่เราเชื่อมั่นได้ว่ามีอยู่แน่ๆในระบบที่เรากำลังทดสอบ gene ตัวที่เราสนใจ จะได้มี control เป็นตัวเปรียบเทียบและควบคุมคุณภาพของวิธีการของเรานั่นเองค่ะ ใน human มีอีกหลายตัวให้เลือกนะคะ ถ้าค้น literature เยอะๆก็จะรู้ว่าใน gene ที่เราสนใจนั้นโดยทั่วไปแล้วเขาใช้ gene อะไรเป็น control ถ้าเราตรวจสอบ primer ที่เขาตีพิมพ์แล้วว่าตรงจริงไม่มีตัวกวนอะไรก็ควรจะใช้แบบที่มีคนอ้างอิงแล้ว เพราะผลของเราก็จะได้มีตัวให้เปรียบเทียบอย่างเป็นสากลกับเขานั่นเองค่ะ หวังว่าจะตรงกับคำถามที่ต้องการนะคะ

Minna
IP: xxx.28.62.245
เขียนเมื่อ Thu May 26 2011 16:19:09 GMT+0700 (ICT)

รบกวนสอบถามอาจาร์ยค่ะ

ถ้าหนูสั่งไพรเมอร์ได้มาแล้ว แต่หนูไม่ทราบว่าหนูควรเลือกTmที่เท่าไหร่ค่ะ

เพราะTmที่ทางเอกสารที่แนบมาพร้อมไพรเมอร์ไม่เท่ากัน

และควรเลือกที่ความเข้มข้นที่โซเดียมที่ความเข้มข้นเท่าไหร่ค่ะ

ขอบคุณอาจารย์มากนะค่ะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Fri May 27 2011 01:10:35 GMT+0700 (ICT)

น้อง Minna [IP: 202.28.62.245] คะ หนูต้องลองเช็คโดยการเอา sequence ของ primers ที่ได้มาใส่ในโปรแกรมที่ใช้เช็ค Tm ดูนะคะ เช่น http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/ ซึ่งอันนี้มีความเข้มข้นโซเดียมที่จะใช้ให้เลือกใส่ได้ด้วยค่ะ หนูดูจากที่มีอยู่ก่อนก็ได้มาใช้ความเข้มข้นนั้นได้ไหม แล้วก็เพิ่มลดเอาตามที่เห็นว่าน่าจะใช้ได้แล้วใส่ในโปรแกรมตรวจสอบดูนะคะ ถ้าดูจาก default เขาก็ตั้งไว้ที่ 50mM นะคะ เรื่องนี้มีคนคุยถามตอบกันอยู่อ่านได้ที่ http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/10441.html ด้วยค่ะ ขอให้โชคดีนะคะ ยังไงก็ต้อง optimize ดูก่อนแหละค่ะ เลือก condition แล้วก็ต้องลุ้นกันอยู่ดี เพราะบางทีก็ไม่เป็นไปตามทฤษฎีหรอกค่ะ ดูผลครั้งแรกแล้วค่อยปรับตามที่ได้ ปกติพี่จะเลือกปรับ Mg concentration ก่อนอื่น เพราะปรับง่ายและมักจะได้ผลค่ะ

หญิงหยอง
IP: xxx.28.181.200
เขียนเมื่อ Mon Jun 06 2011 18:37:53 GMT+0700 (ICT)

ขอเรียนปรึกษาอาจารย์ค่ะ

หนูมีปัญหาเกี่ยวกับการไม่คงที่ของ condition ที่ใช้ทำ real time PCR ค่ะ หนูเคย try condition จนได้ single peak และ run gel เช็คก็ได้ specific band ถูกต้อง แต่เมื่อนำทำการศึกษาไประยะเวลาหนึ่งพบว่า condition ที่ใช้ให้ผลเปลี่ยนไป คือ เริ่มมี multiple peak เมื่อ run gel เช็คก็พบว่า มี non-specific band เกิดขึ้น ไม่ทราบว่าน่าจะมีสาเหตุเกี่ยวข้องกับอะไรได้บ้างคะ แล้วควรที่จะปรับ condition ใหม่รึเปล่า เนื่องจากผลการศึกษาที่ได้จากช่วงแรกได้ใช้ condition นี้ไปแล้ว หนูจึงไม่อยากเปลี่ยนแปลง condition ใหม่กลัวว่าจะทำให้การทดลองไม่น่าเชื่อถือ

ข้อมูลเพิ่มเติมคือ reagent ของ real time PCR เป็นบริษัทเดียวกัน แต่ต่างล็อต, cell ชนิดเดียวกัน treat ด้วย condition เดียวกัน ต่างกันแค่ล็อตของเซลล์

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Mon Jun 06 2011 23:07:54 GMT+0700 (ICT)

คงต้องตามเช็คกันหลายอย่างหน่อยนะคะ ค่อยๆตัดไปทีละอย่าง เพราะมันค่อนข้าง sensitive เพียงแค่ volume เปลี่ยนไปนิดเดียวก็อาจมีผลให้เกิดอะไรก็ได้เพราะทุกอย่างใน reaction มันน้อยนิดอยู่แล้ว condition น่าจะไม่ผิดหรอกค่ะถ้าเครื่องเดิมแล้วก็ไม่มีปัญหาการ maintenance หรือไฟฟ้าอะไรที่จะทำให้อุณหภูมิไม่ตรงตามที่ตั้ง (แต่บางที run ไปนานๆก็ต้องเช็คดูหน่อยนะคะว่าไม่มีใครมือบอนมาเปลี่ยน condition อะไรของเรา ยิ่งถ้าเป็นเครื่องที่มีคนใช้หลายๆคน อาจเกิดได้เหมือนกัน) ถ้ามั่นใจเรื่อง reagent กับ conc.ที่เขาให้มาแน่ๆ ก็ต้องดูเครื่องไม้เครื่องมือในการทำของเราแหละค่ะคราวนี้ ว่า pipette ได้รับการ calibrate volume ถูกแน่ไหม tip ที่ใช้ตรงกับชนิดของ pipette หรือเปล่ามีโอกาสที่ volume อะไรจะคลาดเคลื่อนไหม

ขอให้หาเจอนะคะ เพราะถ้าไม่งั้นผลก็ใช้เปรียบเทียบกันไม่ได้อยู่แล้วค่ะ run ไปก็เสียทั้งแรงงานและเวลารวมทั้งค่าข้าวของด้วยค่ะ

หญิงหยอง
IP: xxx.28.182.5
เขียนเมื่อ Tue Jun 07 2011 14:34:48 GMT+0700 (ICT)

หนูจะลองเอาจุดต่างๆที่อาจารย์ว่ามาไปลองเช็คดู ขอบคุณมากๆสำหรับคำแนะนำค่ะ ^^

ninny
IP: xxx.87.134.72
เขียนเมื่อ Thu Nov 24 2011 21:29:41 GMT+0700 (ICT)

หนูอยากทราบว่าปัจจุบันนี้เขาใช้อะไรเป็น internal control นอกเหนือจาก House-keeping genes เพราะไม่สามารถรู้ได้ว่ามีจำนวนเท่าไร ต้อง limit primer ที่เหมาะสม พอดีหนูทำวิจัยเกี่ยวกับ internal control ก็เลยอยากทราบว่าเขาใช้อะไรบ้าง มีข้อดีข้อเสียอยางไรค่ะ

ขอบคุณล่วงหน้าค่ะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Thu Nov 24 2011 23:15:24 GMT+0700 (ICT)

หนู ต้องหา review papers เกี่ยวกับเรื่องนี้มาอ่านและวิเคราะห์ดูนะคะ ที่ http://gene-quantification.com/hkg.html ก็ถือเป็นที่หนึ่งซึ่งใช้ได้ค่ะ

jo
IP: xxx.12.97.118
เขียนเมื่อ Tue May 29 2012 09:57:22 GMT+0700 (ICT)

สวัสดีครับ ขอรบกวนถามเกี่ยวกับเรื่อง อุณหภูมิในขั้นตอน annealing ของไพรเมอร์ ระหว่างการทำ PCR และ real-time PCR หน่อยนะครับ... คือว่า ผมทำ PCR ด้วยเครื่อง MJ Mini แล้วได้อุณหภูมิที่เหมาะสม คือ 52 องศาเซลเซียส แต่เมื่อนำไพรเมอร์และตัวอย่างเดียวกันกับที่ทำใน PCR แล้วมาทำใน real-time PCR ด้วยเครื่อง CFX96 ปรากฏว่า อุณหภูมิที่เหมาะสม คือ 49 องศาเซลเซียส ผมอยากทราบว่าทำไมอุณหภูมิถึงมีความแตกต่างกันนะครับ สาเหตุเกิดจากอะไรเหรอครับ...ผมขอรบกวนอาจารย์ด้วยนะครับ...ขอบคุณครับ

jo
IP: xxx.12.97.118
เขียนเมื่อ Tue May 29 2012 10:00:52 GMT+0700 (ICT)

จากความเห็นข้างบนนะครับ อาจารย์พอจะมี ref. ข้อมูลหรือปล่าวครับ...ขอบคุณครับ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Thu May 31 2012 14:31:12 GMT+0700 (ICT)

คุณjo [IP: 202.12.97.118] คะ ที่เคยทำก็พบเหมือนกันค่ะ ว่า annealing temp ที่ใช้ใน PCR condition เวลาทำในเครื่อง MJ จะสูงกว่าเวลาเอาไปทำในเครื่อง real-time ไม่แน่ใจว่าเป็นเพราะวิธีการ generate heat ของระบบที่ต่างกันไหมนะคะ ไม่เคยหาเหตุผลแต่คิดว่าน่าจะใช้จากเครื่อง MJ แค่เป็นแนวทางในการเลือก annealing temp สำหรับเครื่อง real-time PCR ก็พอค่ะ มีบทความน่าสนใจในการ optimize annealing temperature ที่นี่ ลองอ่านดูนะคะว่ามีประโยชน์ไหม ถ้าสงสัยยังไงถามมาอีกได้ค่ะ ถ้าช่วยได้จะช่วยหาคำตอบให้ (ได้ฟื้นความรู้ไปด้วย) 

ออม
IP: xxx.28.118.122
เขียนเมื่อ Sat Jul 28 2012 11:57:10 GMT+0700 (ICT)

อยากสอบถามเรื่องเทคนิค DIAPOPS (PCR-ELISA) หน่อยนะคะว่ามีหลักการอย่างไร หนูอ่านเเล้วงงคะ ^^ ที่บอกว่าจะมีการ coat primer ไว้ที่ well จากนั้นใน reaction mixture จะมี primer 1:primer 2 เป็น 1:8 เเล้วเมื่อทำ PCR จะได้ Amplicon มา 2 เเบบ คือเเบบที่ อยู่ใน liquid phase เเละ solid phase เเล้วเตามหลักการบอกล้างออก จากนั้นเหลือส่วนที่อยู่ solid phase ให้เติม NaOH เพื่อทำให้เป็น single stand เเล้วใส่ prob ตรวจวัด ตามด้วย substrate เพื่อ develop สี หนูเข้าใจถูกมั้ยคะ เเล้วทำไมต้องทำให้เป็น single stand อ่านไปก็งงไป ^^ รบกวนผู้รู้ช่วยตอบด้วยนะคะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Sat Jul 28 2012 14:34:56 GMT+0700 (ICT)

หนูออมคะ

ที่นี่ http://www.thermoscientific.jp/lab-products/plasticware/data/technote/2-11.htm มีคำอธิบายที่ชัดขึ้นสำหรับคำถามของหนูค่ะ ว่าทำไมถึงต้องเป็น single strand  เห็นจากภาพเลยค่ะ

ส่วนอื่นๆหนูเข้าใจถูกต้องแล้วค่ะ เทคนิคนี้เขาบอกว่ามันช่วยลดขั้นตอนและลดการปนเปื้อน ( DIAPOPS simplifies manipulations and reduces contamination, since no transfer of amplicon is needed.) แต่ดูแล้วอาจจะแพงกว่าแบบที่เราคุ้นๆกันนะคะ อาจจะใช้สำหรับการตรวจหาเชื้อมากกว่าแค่ทำ PCR น่ะค่ะ แบบนี้ความจำเพาะน่าจะดี

ออม
IP: xxx.12.97.117
เขียนเมื่อ Sat Jul 28 2012 20:49:56 GMT+0700 (ICT)

ขอบคุณคะ ^^ หนูจะพยายามศึกษาดู

ออม
IP: xxx.12.97.117
เขียนเมื่อ Sat Jul 28 2012 21:17:39 GMT+0700 (ICT)

หนูสงสัยอีกเรื่องคะ ^^ คือหนูอ่าน paper ภาษาอังกฤษเค้าบอกว่าเปรียบเทียบวิธี PCR กับ DIAPOPS เวลาที่ได้ PCR product ในส่วนของ PCR เอาไป run agalose gel เเต่ทำไม่ PCR product ของ DIAPOPS ถึงต้อง run ใน PAGE เพื่อยืนยัน คะ ทำไมไม่ทำ run agalose gel เหมือนกัน ไม่ทราบว่าเพราะอะไรหรือคะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Sun Jul 29 2012 00:28:21 GMT+0700 (ICT)

ขอลิงค์ paper ที่ว่าหน่อยนะคะ เพราะเท่าที่พี่อ่านๆดูผ่านๆ วิธี DIAPOPS นั้นใช้วิธี detect PCR product โดยตรงใน well เลยซึ่งไม่ต้องเอามา run gel แล้วนี่คะ ซึ่งถือเป็นข้อดีของวิธีนี้ เลยสงสัยว่า paper ที่หนูว่าเขาจะเปรียบเทียบอะไรหรือเปล่า เขาถึงเอาไป run PAGE เพราะปกติการที่จะใช้ PAGE หรือ agarose นั้นน่าจะขึ้นกับขนาดของ PCR product ที่เราต้องการดู band น่ะค่ะ ถ้ามันขนาดเล็กและอยากแยกให้เห็นชัดๆก็ใช้ PAGE จะดีกว่าเช่นทำ SNP ของ PCR products ที่ขนาดมันต่างกันไม่มาก ถ้าใช้ agarose อาจจะอ่านยากกว่า ถ้าเป็นทั่วๆไปที่ไม่ต้องการความละเอียดในการแยก product ใช้ agarose ถูกกว่าและปลอดภัยกว่า ใช้งานก็ง่ายกว่า ไม่น่าจะเกี่ยวกับวิธี PCR นะคะ

ออม
IP: xxx.12.97.117
เขียนเมื่อ Sun Jul 29 2012 09:26:04 GMT+0700 (ICT)

http://journals.tums.ac.ir/upload_files/pdf/_/20429.pdf

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Sun Jul 29 2012 11:50:13 GMT+0700 (ICT)

น้องออมคะ

เป็นไปตามคาดค่ะ คือการ detect ของ DIAPOPS ใช้เครื่อง ELISA reader แต่ที่เขาเอามา run gel เพราะเขาต้องการเปรียบเทียบ sensitivity ของวิธีค่ะ และที่ใช้ PAGE เพราะเมื่อ run agarose แล้วมัน detect ไม่ได้น่ะค่ะ

"The PCR-ELISA positive samples that could not be
detected on agarose gel were tested using a 6% (w/v)
polyacrylamide gel electrophoresis.

ออม
IP: xxx.28.118.122
เขียนเมื่อ Sun Jul 29 2012 12:52:00 GMT+0700 (ICT)

ขอบคุณมากๆเลยคะ ^__^

ออม
IP: xxx.12.97.119
เขียนเมื่อ Mon Jul 30 2012 16:19:52 GMT+0700 (ICT)

หนูอยากทราบว่า primer GP5+/GP6+ เเละ MY09-MY11 ต่างกันมั้ยคะ หรือว่ามันจำเพาะต่อ L1 gene ของ HPV เหมือนกัน เเล้วการที่เราใช้primer เหล่านี้มันเเยก HPV type ได้มั้ยคะ หรือบอกเพียงเเค่ว่า มันเป็นเชื้อ HPV เท่านั้น คะ ^^

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Mon Jul 30 2012 16:37:16 GMT+0700 (ICT)

หนูต้องไปดูใน paper no.4 ใน references ของ paper ที่หนูอ่านนี่แหละค่ะว่าเขาบอก sequence ไว้ไหม แล้วดูว่ามันต่างกันหรือเปล่า เพราะใน text เขาแค่บอกว่า 

Among all of the general primer PCR assays, the GP5+/GP6+ and MY09/MY11 PCR systems are most frequently used and clinically
evaluated (4)

ซึ่งเราก็ต้องไปค้นต่อดูเอง นี่คือระบบการอ่านค้นข้อมูลค่ะ ใน paper นั้นควรจะมี แต่าถ้าไม่มีหนูก็อาจจะเอาชื่อ primer นี้ไปลองค้นดูใน Entrez databases ดูได้ค่ะ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/tools/restable_mol.html ใน database นั้นเราจะสามารถเช็คได้ว่า primer ไหน match กับยีนที่เราสนใจแค่ไหน ลองดูนะคะ สงสัยยังไงค่อยถามมาใหม่

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Wed Nov 07 2012 08:01:55 GMT+0700 (ICT)

มีข้อสงสัยที่ถามมาทางเมล ขอนำมาแลกเปลี่ยนไว้ในบันทึกนี้ด้วยนะคะ เผื่อใครมีความเห็นอื่นๆจะได้ช่วยกันแชร์

สิ่งที่ผมสงสัยเกี่ยวกับ real time PCR คือ 1.ทำไมเราต้องทำการ dilute ตัวอย่างด้วย 2.ผลจากการdilute บอกอะไรเราได้บ้าง

คำถามกว้างไปนิดนะคะ เพราะไม่แน่ใจว่าหมายถึงตัวอย่างที่เป็นอะไร แต่เท่าที่นึกออก หากเป็น cDNA ที่เรา Reverse transcribed มาก็เพื่อที่เราจะได้สามารถหาปริมาณได้ (quantitate) หากเป็นกรณีอื่นก็น่าจะเป็นว่า เราคิดว่าปริมาณตั้งต้นอาจจะมากเกินไป จะยากต่อการวิเคราะห์ผล เพราะหลังจาก amplify แล้ว product อาจจะเพิ่มมากจนดูยาก

ส่วนผลจากการ dilute ก็ทำให้เราสามารถเปรียบเทียบปริมาณได้ (ตรงไปตรงมาตามหลักการทางเคมีนั่นแหละนะคะ)

ไม่แน่ใจว่าเข้าใจคำถามถูกหรือเปล่า ถ้ายังไงก็แลกเปลี่ยนกันได้นะคะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Wed Nov 07 2012 08:13:49 GMT+0700 (ICT)

มีคำถามมาทางเมลที่คิดว่า ควรจะเอามาลงในบันทึกนี้เพื่อแลกเปลี่ยนเรียนรู้กันนะคะ 

สิ่งที่ผมสงสัยเกี่ยวกับ real time PCR คือ
1.ทำไมเราต้องทำการ dilute ตัวอย่างด้วย
2.ผลจากการdilute บอกอะไรเราได้บ้าง

คำถามกว้างไปสักนิดเพราะไม่แน่ใจว่าตัวอย่างหมายถึงอะไรนะคะ เท่าที่พอจะนึกได้ก็น่าจะเป็นเพราะเราประเมินแล้วว่าปริมาณ product ตั้งต้นมากไป เราจึงต้องเจือจาง เพื่อให้สามารถวิเคราะห์ผลจาก real-time pattern ได้ง่ายขึ้น หรือหากเป็นกรณีที่เราวัด cDNA ที่ reverse transcribed มาก็น่าจะเพื่อหาปริมาณ (quantitate) และการ dilute ก็เพื่อให้สามารถบอกปริมาณได้ เมื่อเราเทียบกับค่าตั้งต้นที่เราสามารถวัดค่า cDNA ได้โดยตรง และสามารถใช้เป็น standard curve ได้เมื่อเรารู้ปริมาณที่แน่นอน (ตรงไปตรงมาตามหลักการเคมีนั่นแหละค่ะ) 

ไม่แน่ใจว่าตอบได้ตรงคำถามหรือเปล่า มีอะไรแลกเปลี่ยนกันมาได้นะคะ เราต้องช่วยกันสร้างวัฒนธรรมการแลกเปลี่ยนเรียนรู้ อย่าคิดว่าผู้เชี่ยวชาญหรืออาจารย์รู้มากกว่า หากเราคิดอะไรก็ควรจะแลกเปลี่ยนกันได้ เพราะความรู้ไม่มีการหยุดนิ่ง เราควรเป็นทั้งผู้รับและผู้ให้ ความรู้ถึงจะแตกยอดนะคะ 

ออม
IP: xxx.2.157.13
เขียนเมื่อ Mon Jan 07 2013 09:49:01 GMT+0700 (ICT)

 อาจารย์คะ หนู่สงสัยเรื่องค่า Tm ของ primer
 บางหลอดไม่บอกค่า Tm มาให้ พอหนูลองคำนวณโดยใช้โปรเเกรม (ใส่เเค่ลำดับเบสเข้าไปคำนวณ) ก็ได้ค่า Tm มาเเต่พอลองเอา Primer ที่มีค่า Tm ให้มาอยู่เเล้ว ไปคำนวณดู ปรากฎว่าค่าที่ได้จากโปรแกรมสูงกว่าค่าที่ให้มากับ Primer ถึง 4-5 องศา เลยคะ ตกลงว่าหนูควรเชื่อโปรเเกรมได้มั้ยคะ

โอ๋-อโณ
เขียนเมื่อ Mon Jan 07 2013 10:46:48 GMT+0700 (ICT)

หนูออมคะ

เรื่องนี้เป็นเรื่องไม่เล็กเหมือนกันค่ะ สำหรับ PCR สำหรับโปรแกรมที่คำนวณก็ต้องดูว่าเขาใช้พื้นฐานอะไรบ้างในสูตรการคำนวณ เพราะแต่ละสูตรอาจจะไม่เหมือนกันซะทีเดียว และความยาวของ template ก็มีส่วนต่อความแม่นยำของการคำนวณด้วย ได้ลองของที่นี่ หรือยังคะ เขามีรายละเอียดอธิบายไว้ด้วยว่าเขาคิดมายังไง ที่อื่นๆบางที่แค่ให้เราใส่ตัวเลขแล้วก็คิดออกมา ส่วนที่ติดมากับหลอดนั้น เขาอาจจะได้มาจากการวัดจริงในเครื่องตอนที่เขาสังเคราะห์โดยที่มี buffer อยู่ด้วยก็ได้ค่ะ (อันนี้พี่เดาเอาไม่ได้รู้จริงๆว่าเขาวัดกันยังไง) 

แต่ยังไงก็ตาม เวลาเราเอามาใช้จริงๆก็ยังต้อง optimize อยู่ดีนะคะ อาจจะในช่วงค่าที่ครอบคลุม Tm ที่คำนวณหรือเขาบอกมา ยังมีอีกหลายปัจจัยให้พิจารณานะคะ PCR เป็นศิลปะจริงๆไม่มีอะไรตายตัวต้องลองทำดูจริงๆเท่านั้นค่ะ

ออม
IP: xxx.12.97.113
เขียนเมื่อ Mon Jan 07 2013 15:24:18 GMT+0700 (ICT)

ขอบคุณคะ ^^

ฝ้าย
IP: xxx.49.243.250
เขียนเมื่อ Sun Jan 13 2013 22:36:12 GMT+0700 (ICT)

อาจารย์คะ อยากทราบว่ามีโปรแกรมออกแบบ primer ที่สามารถใส่ข้อมูลแบบ หลายๆ sequence  ที่สามารถโหลดใช้ได้โดยไม่เสียเงินมั้ยคะ

รายการนี้มีมากกว่า 100 ความเห็น อ่านทั้งหมด   อ่าน
 อนุญาตให้แสดงความเห็นได้เฉพาะสมาชิก
 ไม่อนุญาตให้แสดงความเห็น
{{ kv.current_user.preferred_name }} - เพิ่มความเห็นเพิ่มความเห็น
 ใส่รูปหรือไฟล์
 
บันทึกที่เกี่ยวข้อง
บันทึกก่อนนี้
บันทึกใหม่กว่า