การพัฒนาวิธีการทดสอบหาแบคทีเรียกลุ่ม Enterococci ในน้ำทะเล (ตอนที่ 2)

จากการศึกษาขั้นตอนต่างๆ ของการตรวจวิเคราะห์ Enterococci ในน้ำทะเลตามเอกสารวิธีทดสอบที่ได้จัดทำขึ้น  เราก็มาทำการตรวจวิเคราะห์กันเลย

 เริ่มจากการเตรียมอุปกรณ์และเครื่องแก้วต่างๆ ซึ่งไม่ต่างจากการตรวจวิเคราะห์ Fecal Coliform เพราะใช้วิธี Membrane Filter เหมือนกัน ในส่วนของอาหารเลี้ยงเชื้อและขั้นตอนการยืนยันเชื้อ Enterococci จะเยอะและยุ่งยากมากกว่า Fecal Coliform

1. อาหารเลี้ยงเชื้อ ที่ใช้ในการตรวจวิเคราะห์ Enterococci ประกอบไปด้วย

• mE agar
• EIA (Esculin Iron Agar)  

ในส่วนของการตรวจยืนยันเชื้อ (confirm) ประกอบไปด้วย

• BHIB (Brain Heart Infusion Broth)
• BHIB with 6.5% NaCl
• BHIA (Brain Heart Infusion Agar)
• BEA (Bile Esculin Agar)

และมีการย้อมสี Gram stain เพื่อดูลักษณะของเชื้อ Enterococci ด้วย  

2. ขั้นตอนการตรวจวิเคราะห์ 

 

• ทำการกรองน้ำตัวอย่าง โดยเลือกปริมาตรของตัวอย่างที่ต้องการจะกรอง เพื่อให้ได้โคโลนีประมาณ 20-60 โคโลนี  ปกติจะเลือกใช้ 100,50,5 ml  กรองตัวอย่างผ่านกระดาษกรอง membrane cellulose nitrate 0.45 µm., 47 mm. แล้วนำแผ่นกระดาษกรองไปวางลงบนจานเพาะเชื้อ mE agar แล้วนำ incubate ที่อุณหภูมิ 41 ± 0.5°C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง

• ทำการย้ายแผ่นกรอง membrane ไปลงบนจานเพาะเชื้อของ EIA วางไว้ที่อุณหภูมิห้องก่อนประมาณ 20-30 นาที และ incubate ต่อไปที่อุณหภูมิ 41 ± 0.5°C เป็นเวลา 20-30 นาที  หลังจากการ incubate ให้ทำการนับและบันทึกโคโลนีที่พบ โดยนับโคโลนีที่ให้สีชมพูถึงแดงเข้มบน mE agar และให้สีน้ำตาลถึงดำบน EIA  โดยในจานเพาะเชื้อ EIA ให้อ่านด้านหลังจาน นับโคโลนีที่เกิดการซึมกระจายตัวในอาหารเลี้ยงเชื้อ EIA นั่นคือ เชื้อ Enterococci  เลือกจานเพาะเชื้อที่มีเชื้อขึ้นเหมาะสม คือ ประมาณ 20-60 โคโลนี ใช้ในการรายงานและคำนวณผล

     

• การตรวจยืนยันเชื้อ  ให้ทำการถ่ายเชื้อที่มีการซึมกระจายตัวใน EIA โดยใช้ needle ที่ทำการฆ่าเชื้อแล้วเขี่ยตรงกลางโคโลนีที่กระจายตัวดีอย่างน้อย 10 โคโลนี ลงในหลอด BHIB และลงบนหลอด BHIA slant ทำการ incubate BHIB 24 ชั่วโมง และ BHIA slant 48 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 35 ± 0.5°C 

• หลังจาก 24 ชั่วโมง ให้ถ่ายเชื้ออีกครั้ง โดยใช้ loop ที่ทำการฆ่าเชื้อแล้ว จากหลอด BHIB  ลงใน BEA, BHIB และ BHIB with 6.5% NaCl  ทำการ incubate BEA และ BHIB with 6.5% NaCl ที่อุณหภูมิ 35 ± 0.5°C 48 ชั่วโมง และ incubate  BHIB ที่อุณหภูมิ 45 ± 0.5°C 48 ชั่วโมง  ทำการสังเกตการเจริญเติบโตของเชื้อ Enterococci จากอาหารทั้ง 3 ชนิด

• ทำการย้อมสีแกรมในส่วนของ BHIA slant เมื่อทำการ incubate ครบ 48 ชั่วโมงแล้ว และบันทึกผลเก็บไว้

3. สรุปผลการตรวจวิเคราะห์

กรณีที่เป็น enterococci จะให้ผลดังนี้ คือ

• ผลการย้อมสีแกรม เชื้อจะเป็น Gram positive cocci (ติดสีม่วง รูปร่างกลม)

• เจริญและมีการสลาย esculin ใน BEA  โดยจะเปลี่ยนอาหารในหลอดเป็นสีดำหรือสีน้ำตาลเข้ม

• เจริญใน BHIB ที่อุณหภูมิ 45 ± 0.5°C และ BHIB with 6.5% NaCl ที่อุณหภูมิ 35 ± 0.5°C  โดยสีเหลืองของอาหารจะขุ่นขึ้นกว่าเดิม

 

4. ปัญหาในการตรวจวิเคราะห์

      เนื่องจากเป็นการพัฒนาวิธีทดสอบใหม่ ซึ่งไม่เคยทำการทดสอบมาก่อนเลย ทำให้มีปัญหาในการทดสอบเกิดขึ้นหลายอย่าง เช่น

• ไม่เข้าใจการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อที่ถูกต้อง ในอาหารที่ต้องเติมเกลือลงไป ทำให้เกิดการผิดสัดส่วนของเกลือ เนื่องจากอาหารเลี้ยงเชื้อเองก็มีเกลือผสมอยู่แล้ว ทำให้การทดสอบในครั้งแรกไม่สำเร็จ จึงต้องมาทำการหาข้อผิดพลาดกันใหม่ และได้ไปศึกษาเอกสารอื่นๆ เพิ่มเติม จึงทราบถึงข้อผิดพลาดที่เกิดขึ้น
• ไม่ศึกษาวิธีทดสอบให้ละเอียด ทำให้เกิดความผิดพลาดในการอ่านโคโลนีบนอาหารเลี้ยงเชื้อ EIA ซึ่งต้องสังเกตโคโลนีที่สามารถย่อย EIA และเปลี่ยนสีโคโลนีเป็นน้ำตาลถึงดำ โดยการดูโคโลนีต้องดูจากด้านหลังของจานเพาะเชื้อ  ไม่สามารถดูจากด้านหน้าได้  การทดสอบครั้งแรกจึงเกิดการผิดพลาด  ทำให้ต้องไปศึกษาเอกสารอื่นๆ เพิ่มเติม  และดูภาพที่เกิดจากการทำปฏิกิริยาของเชื้อบนอาหาร EIA จาก internet มาเปรียบเทียบจึงเข้าใจลักษณะของสี และปฏิกิริยาที่เกิดในการ confirm เชื้อบนอาหาร EIA
• ด้วยงบประมาณที่มีอยู่อย่างจำกัดของห้องปฏิบัติการ  ในการพัฒนาการตรวจวิเคราะห์ enterococci  ซึ่งใช้งบประมาณไปในการจัดหาสารเคมี และอาหารเลี้ยงเชื้อ ซึ่งค่อนข้างมีราคาสูง งบประมาณจึงไม่เพียงพอ บางสารเคมีที่จำเป็นต้องใช้ในการตรวจยืนยันเชื้อ เช่น สีย้อมแกรม ซึ่งใช้ในปริมาณที่ไม่มาก แต่จำเป็นต้องใช้ ทำให้ต้องหามาโดยการขอจากห้องปฏิบัติการของโรงพยาบาล  โดยใช้ความสัมพันธ์ส่วนตัวของเจ้าหน้าที่

 

    ถึงแม้ว่าเราทำการทดลองตรวจวิเคราะห์ไปแล้ว  แต่ทักษะ  ความชำนาญ ความมั่นใจในการอ่านผลการทดสอบ ยังคงต้องทำการฝึกฝนให้เกิดความชำนาญมากขึ้น ทั้งในเรื่องการดูลักษณะของโคโลนีและ confirm เชื้อเพิ่มขึ้นอีก   ซึ่งเมื่อนำวิธีการทดสอบที่พัฒนาขึ้นนี้ไปใช้ในการทดสอบตัวอย่างจริง  จะได้มีความถูกต้อง แม่นยำ เชื่อถือได้  และข้อมูลที่ได้จากการทดสอบของห้องปฏิบัติการสามารถนำไปใช้ในการจัดประเภทคุณภาพน้ำทะเลตามมาตรฐานคุณภาพน้ำทะเลในระดับประเทศได้