ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระจากใบ และดอกโหระพา

ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระจากใบ และดอกโหระพา (โปรเจ็ค)

 

ความสำคัญและที่มาของปัญหา 

        อนุมูลอิสระ (Free radical) มีบทบาทสำคัญในกระบวนการเกิดโรคต่างๆ หลายชนิด การมีอนุมูลอิสระมากเกินสมดุลก่อให้เกิดภาวะที่เซลล์และร่างกายถูกออกซิไดซ์ หรือภาวะออกซิเดทีฟสเตรส (Oxidative stress) ซึ่งสามารถนำไปสู่การทำลายเซลล์และเนื้อเยื่อของสิ่งมีชีวิตได้ (1) โดยทั่วไปการสร้างอนุมูลอิสระเกิดขึ้นตลอดเวลา แต่ร่างกายมีระบบในการป้องกันตัวเอง และสามารถช่วยลดความรุนแรงจากพิษของอนุมูลอิสระได้โดยอาศัยสารต้านอนุมูลอิสระ (Antioxidant) ซึ่งเป็นสารที่สามารถทำปฏิกิริยากับอนุมูลอิสระได้โดยตรง เพื่อกำจัดอนุมูลอิสระให้หมดไป หรือหยุดปฏิกิริยาลูกโซ่ไม่ให้ดำเนินต่อ สารต้านอนุมูลอิสระที่มีอยู่ตามธรรมชาติ เช่น วิตามินซี (Ascorbic acid), วิตามินอี (α-Tocopherol) และกลูตาไธโอน (Gluthatione) เป็นต้น(2) จากการศึกษาที่ผ่านมาพบว่าสมุนไพรและผักพื้นบ้านไทยหลายชนิดมีสารประกอบฟีนอลิก (Phenolic compound) ซึ่งมีคุณสมบัติเป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่ทำหน้าที่ป้องกันการเกิดภาวะออกซิเดทีฟสเตรสเป็นองค์ประกอบ ทำให้ผู้คนเล็งเห็นถึงความสำคัญของการบริโภคผักและสมุนไพรพื้นบ้านที่ปลอดสารพิษมากขึ้นเพื่อเสริมสร้างสุขภาพที่ดี

        โหระพา (Ocimum basilicum Linn.) เป็นพืชในวงศ์ Lamiaceae นิยมใช้ในการปรุงอาหารไทยหลายชนิด มีสรรพคุณช่วยในการแก้ลมวิงเวียน ขับลมในลำไส้ แก้ท้องอืด ท้องเฟ้อ แก้หูด แก้ปวดหัว แก้ไอ และแก้ท้องเสีย เป็นต้น(3,4) สารสกัดจากเมล็ด ราก ดอก ลำต้น และใบโหระพาถูกนำมาประยุกต์ใช้ทางการแพทย์อย่างหลากหลาย จากการศึกษาที่ผ่านมาพบว่าสารสกัดจากโหระพามีฤทธิ์ในการลดการเกิดลิ่มเลือดในหลอดเลือด ลดระดับไขมันชนิด LDL และเพิ่มระดับไขมันชนิด HDL ในเลือดได้ ป้องกันการเกิดโรคที่เกี่ยวกับระบบหัวใจและหลอดเลือด ต้านการอับเสบ และยับยั้งสารก่อมะเร็ง(5-7) นอกจากนี้ยังสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียและเชื้อราบางชนิดได้ เช่น Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Aspergillus niger และ Rhizopus solani เป็นต้น(8-12) จากการศึกษาของ Maisuthisakul และคณะ (2008) พบว่าใบโหระพาที่สกัดด้วยเอทานอลมีสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมด (Total phenolic content) เท่ากับ 50.5 mg GAE/g และสามารถกำจัดอนุมูลอิสระดีพีพีเอช (DPPH^·) ได้โดยมีค่าความเข้มข้นของสารสกัดที่สามารถกำจัดอนุมูลอิสระดีพีพีเอชได้ 50% (EC₅₀) เท่ากับ 1.8 กรัมต่อลิตร(13) นอกจากนี้จากศึกษาฤทธิ์ต้านอุนุมูลอิสระดีพีพีเอชในน้ำมันหอมระเหยของโหระพาในแต่ละฤดูกาลพบว่าน้ำมันหอมระเหยของโหระพาในฤดูหนาวมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระดีพีพีเอชได้ดีที่สุด รองลงมาคือ ฤดูใบไม้ผลิ ฤดูใบไม้ร่วง และฤดูร้อน ซึ่งมีค่าความเข้นข้นของสารสกัดที่สามารถกำจัดอนุมูลอิสระดีพีพีเอชได้ 50% (IC₅₀) เท่ากับ 4.8 ± 0.1 , 5.3 ± 0.2 , 6.0 ± 0.2 และ 6.7 ± 0.1 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ(14)

        ปัจจุบันผู้คนให้ความสำคัญ และหันมาบริโภคสมุนไพรและผักพื้นบ้านไทยมากขึ้น ซึ่งโหระพาเป็นผักพื้นบ้านที่นิยมใช้ในการปรุงอาหาร แต่งกลิ่น และรสชาติอาหาร รวมถึงเป็นสมุนไพรพื้นบ้านที่มีการใช้เป็นประจำ ดังนั้นผู้วิจัยจึงมีความสนใจที่จะศึกษาฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดจากโหระพา โดยจะทำการวัดปริมาณสารประกอบฟีนอลิก ซึ่งเป็นแหล่งสำคัญของสารต้านอนุมูลอิสระ และทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระดีพีพีเอช (DPPH radical) จากสารที่สกัดได้จากใบ และดอกโหระพาซึ่งเป็นส่วนที่นิยมนำมารับประทานมากที่สุด เพื่อเป็นฐานข้อมูลทางวิทยาศาสตร์ในการสนับสนุนฤทธิ์ในการต้านอนุมูลอิสระของโหระพา และเพิ่มคุณค่าของผักพื้นบ้านไทยให้มีมูลค่ามากขึ้น และนำไปประยุกต์ใช้ในทางการแพทย์ต่อไป

 

วัตถุประสงค์

1. เพื่อวัดปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมด (Total phenolic content) ของสารสกัดจากใบ และดอกโหระพา
2. เพื่อศึกษาฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดจากใบ และดอกโหระพา

 

ประโยชน์ที่คาดว่าจะได้รับ 

        ทราบปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมด และฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดจากใบ และดอกโหระพาที่สกัดด้วยน้ำ และเอทานอล เพื่อเป็นแนวทางในการเลือกบริโภคผักพื้นบ้าน เป็นฐานข้อมูลทางวิทยาศาสตร์ในการสนับสนุนฤทธิ์ในการต้านอนุมูลอิสระของโหระพา และนำไปประยุกต์ใช้ทางการแพทย์ต่อไป

 

รูปแบบการวิจัย 

        เป็นการวิจัยเชิงทดลองเพื่อวัดปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมด และฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดจากใบ และดอกโหระพาที่สกัดด้วยน้ำ และเอทานอล 

 

ขอบเขตการวิจัย 

1. สกัดสารจากใบ และดอกโหระพาด้วยน้ำ และ 95% เอทานอล
2. วัดปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมดของสารสกัดจากใบ และดอกโหระพา โดยวิธี Folin-Ciocalteau method
3. ทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระดีพีพีเอช (DPPH^·) ของสารสกัดจากใบ และดอกโหระพา

 

ขั้นตอนการศึกษา

  1.  การเตรียมและสกัดพืชที่ใช้ในการทดสอบ 

        นำใบ และดอกโหระพามาผึ่งลมให้แห้ง และอบจนแห้งสนิทที่อุณหภูมิประมาณ  50-60  องศาเซลเซียส จากนั้นชั่งใบ หรือดอกโหระพาอบแห้ง จำนวน  30  กรัม สกัดด้วยน้ำกลั่น หรือ 95% เอทานอล จำนวน 300 มิลลิลิตร โดยนำไปต้มและเขย่าบนเครื่องกวนสารพร้อมให้ความร้อน (Hot plate) ที่อุณหภูมิ  56  องศาเซลเซียส  เป็นเวลานาน 12 – 16  ชั่วโมง กรองสารสกัดด้วยผ้าขาวบาง จากนั้นแบ่งน้ำกรองสารสกัดที่สกัดด้วยน้ำกลั่นใส่หลอดทดลอง หลอดละ 20 มิลลิลิตร และอบที่อุณหภูมิประมาณ 50-60 องศาเซลเซียส จนแห้ง และนำผงสารสกัดที่ได้เก็บที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส จนกว่าจะนำไปใช้งาน ส่วนสารสกัดที่สกัดด้วย 95%      เอทานอล นำไประเหยแห้งด้วยเครื่องอบแห้ง (Rotary evaporator) จากนั้นนำผงสารสกัดที่เตรียมได้เก็บที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส จนกว่าจะนำมาใช้งาน

 

2. การวัดปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมด (Total phenolic content)   

        หลักการทดสอบ 

        การวัดปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมดโดยวิธี Folin-Ciocalteu method ประยุกต์จากวิธีของ  Slinkard และคณะ (1977)(15) อาศัยหลักการ คือ สารประกอบฟีนอลิกทั้งหมดทำปฏิกิริยากับ Folin-Ciocalteu reagent ซึ่งประกอบด้วย phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents สารดังกล่าวจะถูกรีดิวซ์โดย phenolic hydroxyl groups ของสารประกอบ       ฟีนอลิกทั้งหมดเกิดเป็น tungsten และ molybdenum blue ซึ่งให้สีน้ำเงินและดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 760 นาโนเมตร

        วิธีการทดสอบ 

        ผสมสารมาตรฐานกรดแกลลิค (Gallic  acid) หรือสารสกัดที่ต้องการทดสอบ ได้แก่  สารสกัดใบโหระพาที่สกัดด้วยน้ำ  สารสกัดใบโหระพาที่สกัดด้วย 95% เอทานอล สารสกัดดอกโหระพาที่สกัดด้วยน้ำ และสารสกัดดอกโหระพาที่สกัดด้วย 95% เอทานอล ที่ความเข้มข้นต่างๆ จำนวน 100 ไมโครลิตร กับน้ำกลั่น จำนวน  4.5 มิลลิลิตร จากนั้นเติม Folin-Ciocalteu reagent จำนวน 100  ไมโครลิตร และ 2% Na₂CO₃ solution จำนวน 300 ไมโครลิตร ผสมให้เข้ากัน ตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องในที่มืดเป็นเวลานาน  2  ชั่วโมง อ่านค่าจากการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น  760 นาโนเมตร วัดปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมดจากกราฟมาตรฐานในหน่วย mg  gallic  acid  equivalents (GAE)/  gram  dried  weight

 

3. การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระดีพีพีเอช (DPPH^·)  

        หลักการทดสอบ 

        การทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระดีพีพีเอชประยุกต์จากวิธีของ Braca และคณะ (2001)(16) อาศัยหลักการ คือ อนุมูลอิสระดีพีพีเอชในสารละลายสีม่วงเข้มได้รับอิเล็กตรอนหรือ H^· จากสารทดสอบ จะกลายเป็นสารประกอบดีพีพีเอชที่เสถียรขึ้นและไม่มีสีม่วงเข้มเหมือนกับอนุมูลอิสระดีพีพีเอช ทำให้ตรวจวัดปริมาณของสารสกัดได้จากค่าการดูดกลืนแสงของสารละลายดีพีพีเอชที่ลดลงที่ความยาวคลื่น 517 นาโนเมตร โดยฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระดีพีพีเอชแสดงในรูปค่าความเข้มข้นของสารสกัดที่สามารถกำจัดอนุมูลอิสระดีพีพีเอชได้ 50% (IC₅₀)  

        วิธีการทดสอบ 

        ผสมสารสกัดที่ต้องการทดสอบ ได้แก่ สารสกัดใบโหระพาที่สกัดด้วยน้ำ สารสกัดใบโหระพาที่สกัดด้วย 95%เอทานอล สารสกัดดอกโหระพาที่สกัดด้วยน้ำ และสารสกัดดอกโหระพาที่สกัดด้วย 95% เอทานอล หรือ ascorbic acid (Positive  control) ที่ความเข้มข้นต่างๆ หรือเมทานอล (Negative  control) จำนวน 100 ไมโครลิตร กับ 0.1 M DPPH solution จำนวน 3 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากัน  ตั้งทิ้งไว้ในที่มืด ที่อุณหภูมิห้อง เป็นเวลานาน 30  นาที  แล้วนำไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น  517  นาโนเมตร คำนวณหาเปอร์เซนต์การกำจัดอนุมูลอิสระดีพีพีเอช (DPPH radical  scavenging  activity) จากสมการดังนี้ 

 

 DPPH radical scavenging activity (%) = (Absorbance Control - Absorbance Sample) × 100

                                                                    Absorbance Control

การวิเคราะห์ข้อมูล

        วิเคราะห์ปริมาณสารประกอบฟีนอลิกทั้งหมด และฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดจากใบ และดอกโหระพาที่สกัดด้วยน้ำ และเอทานอลด้วยสถิติ  One-Way ANOVA

เอกสารอ้างอิง

1. สุพัตรา  ปรศุพัฒนา. อนุมูลอิสระและการทำลายเซลล์. ใน : วงศ์วิวัฒน์ ทัศนียกุล, สุดา วรรณประสาท, วงศ์วิวัฒน์ ทัศนียกูล, ปราโมทย์ มหคุณากร, วินัย วนานุกูล และจารุวรรณ ศรีอาภา, บรรณาธิการ. สาระพิษวิทยา : จากพื้นฐานสู่ข้างเตียงผู้ป่วย พิมพ์ครั้งที่ 2. ขอนแก่น : โรงพิมพ์มหาวิทยาลัยขอนแก่น, 2548 : 96-107.
   1. โอภา วัชระคุปต์, ปรีชา บุญจูง, จันทนา บุณยะรัตน์, มาลีรักษ์ อัตต์สินทอง. สารต้านอนุมูลอิสระ. นนทบุรี : โรงพิมพ์ พี.เอส.พริ้นท์, 2537 : 1,39
   2. เดชา ศิริภัทร. สมุนไพรจากครัวไทย กรุงเทพฯ : สำนักพิมพ์หมอชาวบ้าน, 2546 : 90-91
   3. Simon JE, Morales MR, Phippen WB, Vieira RF, Hao Z. Basil : a source of aroma compounds and popular culinary and ornamental herb. Perspectives on new crops and new uses; In J. Janick (Ed.), Alexandria, VA: ASHS Press 1999 ; 499–505.
   4. Dasgupta T, Rao AR, Yadava PK. Chemomodulatory efficacy of Basil leaf (Ocimum basilicum) on drug metabolizing and antioxidant enzymes and on carcinogen-induced skin and forestomach papillomagenesis. Phytomedicine 2004 ; 11 : 139 –151.
   5. Tohti I, Tursun M, Umar A, Turdi S, Imin H, Moore N. Aqueous extracts of Ocimum basilicum L. (sweet basil) decrease platelet aggregation induced by ADP and thrombin in vitro and rats arterio-venous shunt thrombosis in vivo. Thromb Res 2006 ; 118 : 733–739.
   6. Harnafi H, Caid HS, Bouanani NH, Aziz M, Amrani S. Hypolipemic activity of polyphenol-rich extracts from Ocimum basilicum in Triton WR-1339-induced hyperlipidemic mice. Food Chem 2008 ; 108 : 205-212.
   7. Wannissorn B, Jarikasem S, Siriwangchai T, Thubthimthed S. Antibacterial properties of essential oils from Thai medicinal plants. Fitoterapia 2005 ; 76(2) : 233–6.
   8. Nguefack J, Budde BB, Jakobsen M. Five essential oils from aromatic plants of Cameroon : their antibacterial activity and ability to permeabilize the cytoplasmic membrane of Listeria innocua examined by flow cytometry. Lett Appl Microbiol 2004 ; 39(5) : 395– 400.
   9. Edris AE, Farrag ES. Antifungal activity of peppermint and sweet basil essential oils and their major aroma constituents on some plant pathogenic fungi from the vapor phase. Nahrung 2003 ; 47(2) : 117– 21.
   10. Opalchenova G, Obreshkova D. Comparative studies on the activity of basil—an essential oil from Ocimum basilicum L.—against multidrug resistant clinical isolates of the genera Staphylococcus, Enterococcus and Pseudomonas by using different test methods. J Microbiol Methods 2003 ; 54(1) : 105– 10.
   11. Orafidiya LO, Oyedele AO, Shittu AO, Elujoba AA. The formulation of an effective topical antibacterial product containing Ocimum gratissimum leaf essential oil. Int J Pharm 2001 ; 224(1--2) : 177– 83.
   12. Maisuthisakul P, Pasuk S, Ritthiruangdej P. Relationship between antioxidant properties and chemical composition of some Thai plants. J Food Compos Anal 2008 ; 21 : 229-240.
   13. Hussain AI, Anwar F, Sherazi STH, Przybylski R. Chemical composition, Antioxidant and antimicrobial activities of basil (Ocimum basilicum) essential oils depends on seasonal variations. Food Chemistry 2008 ; 108 : 986-995.
   14. Slingkard K, singleton VL. Total phenal analysis: automation and comparison with manual method. Am J Enol Vitic 1977 ; 28 : 49-55.
   15. Braca et al. Antioxidant principles from Bauhinia terapotensis. J Nat Prod 2001 ; 64 : 892-5.