CaseStudy 12: เมื่อต้องเจอกับ Allele dropout อีกครั้งหนึ่ง

     วันนี้ต้องรายงานผลการตรวจ autosomal STR สำหรับการตรวจพ่อ-ลูก รายหนึ่ง สกัดตัวอย่างตรวจจากเลือดที่ใส่สารกันเลือดแข็งชนิด  EDTA ด้วยวิธี Chelex extraction เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยน้ำยา Identifiler ธรรมดาครับ ได้ผลดังภาพครับ   นี่เป็นตัวอย่างของผู้เป็นพ่อครับ ลองสังเกตุจากตำแหน่ง D2S1338 จะเห็นว่า มี peak ขึ้นอยู่ peak เดียว แต่ peak มีความสูงน้อยกว่า peak ที่ตำแหน่งใกล้ๆ ค่อนข้างมากคับ ที่ตำแหน่งนี้ อ่านได้ 23,23 

     เปรียบเทียบกับ อีกตัวอย่างหนึ่งที่เป็นของลูกสาว  ที่ตำแหน่งเดียวกัน (D2S1338) อ่านได้ 19,19 

 

     เมื่อนำรูปแบบดีเอ็นเอของคนทั้งสองไปเปรียบเทียบกัน จะพบว่า จากการตรวจรูปแบบดีเอ็นเอบนโครโมโซมร่างกายรวม 15 ตำแหน่ง เข้ากันได้ 14 ตำแหน่ง และเข้ากันไม่ได้ 1 ตำแหน่ง  ตำแหน่งที่เข้ากันไม่ได้ คือตำแหน่ง D2S1338 นั่นเอง

     คราวนี้ก็เลยต้องทำซ้ำครับ เลยถือโอกาสเปลี่ยนน้ำยา จากน้ำยา Identifiler ธรรมดา มาเป็นน้ำยา Identifiler Plus อย่างไรก็ตาม เนื่องจากตัวอย่างตรวจที่ทำซ้ำนี้ ถูกนำมาทำพร้อมกับตัวอย่างตรวจจากวัตถุพยานอื่นๆด้วย ผมก็เลยถือโอกาสเติมน้ำยาเทวดา อีกตัวหนึ่งลงไปด้วย นั่นคือ PSU Enhancer  ซึ่งเป็นน้ำยาที่พัฒนาขึ้นใช้เอง เพื่อเพิ่มความไวของการทดสอบ และลด PCR inhibitor ครับ หลังจากที่เปลี่ยนน้ำยาใหม่ นำมาเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ แล้วนำมาเข้าเครื่องอ่าน fragment analysis ได้ผลดังนี้ครับ

     ตัวอย่างตรวจของพ่อ ทดสอบด้วยน้ำยา Identifiler Plus ร่วมกับเติมน้ำยา PSU Enhancer ที่ตำแหน่ง D2S1338 อ่านได้ผลเป็น 23, 26 ครับ มี peak เพิ่มขึ้นมาเป็น 2 peak แล้ว

     เปรียบเทียบกับรูปแบบดีเอ็นเอของลูกครับ ทดสอบใหม่ด้วยน้ำยา Identifiler Plus ร่วมกับเติมน้ำยา PSU Enhancer ได้ผลดังภาพข้างล่างนี้ครับ ที่ตำแหน่ง D2S1338 คราวนี้อ่านผลได้เป็ฯ 19,26

 

     คราวนี้เมื่อนำมาเปรียบเทียบรูปแบบดีเอ็นเอ แล้ว เข้ากันได้ทุกตำแหน่งครับ 

     อ้าว....แล้วไอ้ที่ทำครั้งแรก ตำแหน่ง D2S1338 ทำไมมันขึ้นเป็น homozygous แล้วตำแหน่งเข้ากันไม่ได้ล่ะ ....อีกครั้งหนึ่งที่เจอกับปัญหา Allele Dropout  นี่โชคดีนะ ที่ตำแหน่งที่มี allele dropout มันเข้ากันไม่ได้ ุถ้ามันเข้ากันได้ รายนี้ หลุดไปแน่ๆครับ

     ตอนแรก ผมพยายามอธิบายผลว่า ตำแหน่ง D2S1338 ทดสอบด้วยน้ำยา Identifiler ธรรมดานั้น มันอาจจะมี Primer binding site mutation  ที่โครโมโซมข้างใดข้างหนึ่ง ก็เลยทำให้ขึ้น peak เดียว  ซึ่งตำแหน่งที่เกิด primer binding site mutation นี้ ถ่ายทอดไปให้กับลูกด้วย ก็เลยเกิดปัญหาเดียวกันกับในดีเอ็นเอของลูกด้วย  พอเปลี่ยนมาใช้น้ำยา Identifiler Plus แล้ว มีการออกแบบ primer ใหม่  ทำให้ primer คู่ใหม่นี้ ไปจับกับดีเอ็นเอที่ตำแหน่งใหม่ ก็เลยจับกันได้ โดยไม่มีตำแหน่ง mutation ก็เลยเห็นเป็น 2 peaks ฟังดูก็มีเหตุมีผลดีครับ  แต่พอไปตรวจสอบกับ น้ำยา Identifiler Plus ถึงพบว่า เจ้าน้ำยาตัวใหม่นี้ ใช้ primer คู่เดิมครับ เพียงแต่ ไม่ใช้ linker ในบางตำแหน่ง เพราะฉะนั้น ก็เลยลดในเรื่องของ non specific band แต่ตำแหน่ง และ ขนาดของ PCR ยังคงเดิม เหมือนน้ำยา Identifiler ทุกประการครับ  มาถึงตรงนี้ ผมก็จนด้วยเกล้าแล้วครับ ไม่รู้จะอธิบายปรากฎการณ์นี้อย่างไรดี

     รู้แต่ว่า......เรื่องนี้ น่ากลัวครับ  ไม่รู้ว่า เมื่อไหร่ หรือตัวอย่างตรวจ รายไหน จะหลุดออกไปบ้าง  ยังไงๆ ก็ ลองสังเกตุดูด้วยนะครับว่า  ความสูงของ peak ที่ตำแหน่งไหน มีข้อน่าสงสัยบ้าง เผื่อว่า .....ท่านกำลังเจอกับปัญหา allele dropout เหมือนรายนี้อยู่