ทำไม ฉันสกัดดีเอ็นเอจากเลือด แล้วได้สีเข้มกว่าเธอ ?
ปกติการสกัดดีเอ็นเอสำหรับงานด้านนิติเวชศาสตร์ หรืองานด้านการตรวจพิสูจน์ความสัมพันธ์ทางสายเลือด มักใช้วิธีการสกัดดีเอ็นเอด้วย chelex resin (ดูรายละเอียดได้จากที่นี่ครับ) แล้ววันนี้ก็มีคำถามตามมาว่า "เอ...ทำไมฉันสกัดดีเอ็นเอจากเลือด แล้วได้สีเข้มกว่าเธอนะ ?"
ว่าไปแล้ว การสกัดดีเอ็นเอจากเลือดด้วยวิธี Chelex ในหลักการแล้ว เป็นการผสมเลือดกับน้ำกลั่น แล้วให้เซลล์เม็ดเลือดแดงแตก เนื่องจากน้ำกลั่นจะ osmosis จากภายนอกเข้าสู่เซลล์ ทำให้เซลล์บวมขึ้นเรื่อยๆ จนผนังเซลล์ทนไม่ไหว ก็จะแตกโพละ ส่วนเม็ดเลือดขาว ก็เกิดกระบวนการซึมของน้ำเข้าสู่เซลล์เช่นเดียวกัน แต่ผนังเซลล์ของเม็ดเลือดขาว จะทนแรงดันได้ดีกว่า เม็ดเลือดขาวจึงยังไม่แตก ขณะที่เม็ดเลือดแดงแตกไปแล้ว หลังจากปั่นล้างเซลล์ด้วยวิธีนี้ 2 ครั้ง แล้วเติม chlex resin เข้าไป แล้วนำไปต้มที่ 100 C นาน 8-12 นาที ก็จะได้สารละลายดีเอ็นเอ พร้อมที่จะนำไปใช้ครับ.....แต่คำถามก็คือว่า ทำไมสารละลายดีเอ็นเอที่ฉันทำ ถึงมีสีเข้มกว่าเธอทำล่ะ
คำตอบเรื่องนี้ อยู่ที่ ระยะเวลาหลังจากผสมเม็ดเลือดแดงกับน้ำกลั่นแล้ว ตั้งไว้นานแค่ไหนครับ.....หากผสมแล้วตั้งไว้ไม่นาน เม็ดเลือดแดงส่วนใหญ่จะแตกไปแล้ว แต่ยังคงมีเม็ดเลือดแดงบางส่วนที่แตกยากกว่าค้างอยู่ เจ้าเม็ดเลือดแดงที่ค้างอยู่นี่แหละเป็นที่มาของสีที่เข้มขึ้น หากผสมแล้วตั้งไว้นานขึ้น ก็จะเพิ่มโอกาสให้เม็ดเลือดแดงพวกที่แตกยากกว่าเหล่านี้มีโอกาสที่จะแตกได้มากขึ้น ก็จะทำให้เหลือเม็ดเลือดแดงในหลอดน้อยลง เมื่อนำไปต้ม สีของสารละลายที่ได้ก็จะมีสีจางลง..... ในหลักการก็มีเพียงเท่านี้
แล้วไม่ว่าสารละลายดีเอ็นเอที่สกัดได้ด้วยวิธีนี้ มีสีเข้ม หรือ สีจางก็ตาม เอาไปทำ PCR หรือเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้เหมือนกันไม่ใช่เหรอ....? คำตอบก็คือ แล้วแต่งานครับ.....
ในงานที่ทำ fragment analysis หรือ ทำ fluorescent base PCR นั้น มีการใช้ปริมาณดีเอ็นเอตั้งต้นน้อยมาก เช่น ใส่เข้าไปในปฏิกิริยาด้วยความเข้มข้นประมาณ 2.5-5 ng/ul นั่นหมายความว่าเราจะต้องเจือจางสารละลายดีเอ็นเอที่สกัดได้ประมาณ 8-15 เท่า ซึ่งการเจือจางนี้ เป็นการเจือจางสารยับยั้งปฏิกิริยาเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ (PCR inhibitor) ด้วย จึงทำให้เราสามารถทำ PCR แบบนี้ได้ โดยไม่มีปัญหา
แต่ถ้าเราไปทำ PCR ปกติ ที่ไม่ได้ใช้สัญญาณ fluorescent ในการติดตาม PCR product จะต้องใช้ปริมาณดีเอ็นเอที่มากกว่านี้ ส่วนใหญ่มักจะใช้ undilute หรือไม่เจือจาง นั่นก็หมายความว่า เราจะเสี่ยงต่อการใส่ PCR inhibitor เข้าไปในปฏิกิริยามากขึ้น ทำให้สารเหล่านี้ เข้าไปยับยั้งการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ แม้ว่าในปฏิกิริยาของเรา มีสารดีเอ็นเอตั้งต้นมากเพียงพอก็ตาม ....นั่นคือปัญหาครับ
แล้วอะไรในสีเข้ม.....ที่เป็น สารยับยั้งการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ ล่ะ......คำตอบก็คือ เจ้าสารที่เรียกว่า porphyrin ring ที่อยู่ใน hemoglobin ในเม็ดเลือดแดง เป็นสารตัวหนึ่งที่พิสูจน์ได้แน่ชัดแล้วว่าเป็น PCR inhibitor ครับ ดังนั้น เวลาสกัดดีเอ็นเอจากเลือด เขาจึงให้ทำให้เม็ดเลือดแดงแตกให้หมด ก่อนสกัดดีเอ็นเอจากเม็ดเลือดขาว
เพราะฉะนั้น แม้ว่าจะสกัดดีเอ็นเอออกมาแล้วได้สีเข้ม เอาไปทำ PCR ได้ แต่เพื่อลดความเสี่ยง ทำให้สีมันจางลงกว่านี้เถอะ ก็เพียงแค่แช่เม็ดเลือดแดงไว้ในน้ำกลั่นให้นานขึ้น (ประมาณ 10 นาที แทนที่จะเป็น 1-2 นาที) เราก็จะได้สารละลายดีเอ็นเอ ที่มีสีจางลง มีสาร PCR inhibitor น้อยลง ลดความเสี่ย่งในการทำ PCR แล้วไม่ขึ้น.....แล้วล่ะ
ความเห็น (1)
.. .... ขอบคุณค่ะ ....