CaseStudy11: เมื่อต้องเจอกับ allele drop out

    allele drop out เป็นเรื่องของการที่ตรวจพบว่า จริงๆแล้วมันควรจะมี allele อยู่ แต่พอตรวจแล้วมันหายไป ไม่ว่าเกิดจากสาเหตุใดก็ตาม เป็นเรื่องน่าปวดหัว หรือน่ากลัวอีกเรื่องหนึ่งของการตรวจพิสูจน์ดีเอ็นเอทางนิติเวชศาสตร์  ผมมีกรณีศึกษามาเล่าสู่กันฟังครับ

     กรณีนี้เป็นการตรวจดีเอ็นเอจาก ศพที่ถูกเผา ตำรวจวิทยาการ ส่งกระดูกซี่โครง ของศพ มาตรวจเทียบกับผู้ที่สงสัยว่าจะเป็นพ่อและแม่ของศพ ครับ

     งานนี้สกัดดีเอ็นเอจากกระดูกอ่อนบริเวณซี่โครง ด้วยวิธี Chelex extraction ตรวจวัดปริมาณดีเอ็นเอด้วยวิธี spectrophotometry ที่ OD 260, 280, 320 nm วัดปริมาณดีเอ็นเอได้ 228 ng/ul ขณะที่ ratio 260/320 ไม่สามารถวัดได้ เนื่องจาก OD 320 nm มีค่าสูงกว่า 2 OD ซึ่งนั่นหมายความว่า ในดีเอ็นเอของเรา มี interference เพียบครับ เราจึงไม่สามารถเชื่อถือค่าปริมาณดีเอ็นเอที่วัดได้  งานนี้ก็ต้องประมาณการเองว่าควรเจือจางตัวอย่างตรวจเท่าไหร่ โดยประสบการณ์แล้ว เราก็เริ่มจาก 1:3-1:20  ซึ่งในตัวอย่างนี้ เจือจางตัวอย่างที่ 1:15 ครับ

     เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยน้ำยา identifiler ครับ แล้วใส่เข้าเครื่อง ได้ผลรูปกราฟของตัวอย่างศพ ออกมาดังภาพข้างล่างนี้ครับ

 โดยที่ตำแหน่ง TH01 ขึ้นเป็น 9,9  และตำแหน่ง D16S539 ขึ้นเป็น 10, 10

หากไปเปรียบเทียบกับผู้ถูกกล่าวหาว่าเป็นพ่อ ที่ตำแหน่ง TH01 ขึ้นเป็น 7,7 และตำแหน่ง D16S539 ขึ้นเป็น 10, 11

ส่วนผู้ถูกกล่าวหาว่าเป็นแม่ ที่ตำแหน่ง TH01 ขึ้นเป็น 9,9 และตำแหน่ง D16S539 ขึ้นเป็น 12,13

     นั่นหมายความว่า หากเปรียบเทียบกัน พ่อ-ลูกจะคัดออกที่ตำแหน่ง TH01  และหากเปรียบเทียบแม่-ลูกจะคัดออกที่ตำแหน่ง D16S539  จึงทำให้ต้องกลับมาดูรูปแบบดีเอ็นเอของศพนี้อย่างละเอียดอีกครั้ง

     ตำแหน่งอื่นๆ ของศพรายนี้เปรียบเทียบกับพ่อ-แม่ พบว่าเข้ากันได้หมด

     ลองทำ PCR จาก 28 รอบ เอามาทำเพิ่มขึ้นอีก 5 รอบ แล้วนำกลับมาเข้าเครื่องใหม่ ได้ภาพดังนี้

 

     จะเห็นได้ว่า ได้ผลเหมือนเดิมครับ  แต่รายนี้ เราสังเกตุพบว่า ความสูงของ peak ที่ 28 รอบนั้น ไม่เกิน 1000 rfu ซึ่งถือว่ามีปริมาณดีเอ็นเอค่อนข้างน้อยครับ  ซึ่งอาจเป็นที่มาของบางอัลลีลหายไปได้ (allele drop out) ซึ่งอาจจะเป็นไปได้ จาก  2 สาเหตุใหญ่ๆ ได้แก่

     1. ปริมาณดีเอ็นเอ น้อยเกินไป   วิธีการตรวจสอบคือ ทำการทดสอบใหม่โดยเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอให้มากขึ้น ในที่นี้จึงเจือจางตัวอย่างตรวจเป็น 1:5 แล้วนำมาทดสอบใหม่

     2. มี PCR inhibitor อยู่ในตัวอย่าง แล้วยับยั้งการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอบางตำแหน่ง วิธีการตรวจสอบคือ ทำการทดสอบใหม่ โดยเจือจางตัวอย่างตรวจให้มากกว่านี้ ในที่นี้เจือจางเป็น 1:25 แล้วนำมาทดสอบใหม่

     มาดูผลกันครับ  ในตัวอย่างที่เจือจาง 1:5 ได้ผลดังภาพข้างล่าง  พบว่าที่ตำแหน่ง TH01 ได้ค่า 7,9 และตำแหน่ง D16S539 อ่านได้ค่า 10, 12  คราวนี้เมื่อเปรียบเทียบกับรูปแบบดีเอ็นเอของพ่อ และ แม่ พบว่าสามารถเข้ากันได้ทุกตำแหน่ง

     ขณะที่เมื่อเจือจาง 1:25 นำมาทดสอบซ้ำ แล้วได้ผลดังภาพข้างล่างครับ  พบว่าความสูงของ peak ลดลง และบางตำแหน่งเริ่มอ่านไม่ได้แล้ว 

     แสดงว่า ปัญหาที่ก่อให้เกิดสาเหตุนี้่ มาจากการที่มีปริมาณดีเอ็นเอ ที่เราใส่เข้าไปในปฏิกิริยาน้อยเกินไปครับ 

     ยิ่งทำมาก ยิ่งน่ากลัวครับ  ไม่รู้ว่าที่ผ่านมา ทำหลุดไปบ้างสักกี่รายแล้ว.....