อันเนื่องมาจาก InterlabComparison3: ปัญหาของการตรวจวิเคราะห์ mtDNA ตัวอย่าง PT3-2013 และ PT4-2013

     นี่เป็นตัวอย่าง PT3-2013 และ PT4-2013 ซึ่งเป็นตัวอย่างของลูก-แม่ จึงทำให้มีรูปแบบดีเอ็นเอบนสายไมโตคอนเดรียเหมือนกัน และได้ผลการเปรียบเทียบระหว่างห้องปฏิบัติการ ดังภาพข้างล่างนี้ครับ

     ปัญหาที่พบจากการเปรียบเทียบตัวอย่างตรวจทั้งสองนี้ พบปัญหาต่างๆ ดังนี้

     1. ปัญหาการอ่านผลการตรวจไม่ผ่าน C-stretch บริเวณ HV2 ซึ่งพบในห้องปฏิบัติการ L06

     2. ปัญการการบันทึกตำแหน่งที่แตกต่างจาก rCRS ได้แตกต่างกันทั้งที่มีผลการตรวจวิเคราะห์ลำดับเบสเหมือนกัน  โดยส่วนใหญ่ (จำนวน 5 ห้องปฏิบัติการ) บันทึกตำแหน่ง C-stretch บริเวณ HV2 ได้เป็น 309.1C, 315.1C ขณะที่มีห้องปฏิบัติการ 1 แห่ง บันทึกตำแหน่งที่แตกต่างจาก rCRS บริเวณนี้เป็น 309.1C, 309.2T, 310C  ซึ่งปัญหานี้ เกิดขึ้นเช่นเดียวกับตัวอย่างตรวจที่ PT2-2013 ดูคำอธิบายเพิ่มเติมเรื่องนี้ ได้จากที่นี่ครับ

     3. ปัญหาการวิเคราะห์ลำดับเบสบริเวณ C-stretch ของ HV1 (ตำแหน่งที่ 16184-16193) บริเวณนี้ ตามข้อกำหนดของ SWGDAM (Scientific Working Group on DNA Analysis Methods) ที่กำหนดไว้ว่า บริเวณ C-Stretch ของ HV1 อาจไม่จำเป็นต้องวิเคราะห์จำนวน C ได้ถูกต้องก็ได้ แต่บริเวณ C-Stretch ของ HV2 จำเป็นอย่างยิ่งที่ต้องวิเคราะห์จำนวนเบสให้ถูกต้อง

     เอาล่ะ เรามาดูผลการตรวจบริเวณ C-Stretch ของ HV1 เปรียบเทียบกันครับ

          3.1 ห้องปฏิบัติการส่วนใหญ่ (จำนวน 4 แห่ง) วิเคราะห์จำนวน C ได้ 11 C ดังภาพข้างล่างนี้ครับ จึงบันทึกความแตกต่างจาก rCRS ได้เป็น 16183C, 16189C

          3.2 ห้องปฏิบัติการ 1 แห่ง วิเคราะห์จำนวน C บริเวณนี้ได้จำนวน 12 C  จึงบันทึกความแตกต่างจาก rCRS ได้เป็น 16183C, 16189C, 16193.1C ดังภาพข้างล่างนี้ครับ

          3.3 ห้องปฏิบัติการ 1 แห่ง วิเคราะห์จำนวน C บริเวณนี้ได้จำนวน 10 C จึงบันทึกความแตกต่างจาก rCRS ได้เป็น 16183D, 16189C ดังภาพข้างล่างนี้ครับ

          ดังนั้น ไม่ว่าจะเป็นการตรวจวิเคราะห์ ได้ 12C หรือ 11C หรือ 10C ก็ตาม ในแง่ของการนำไปเปรียบเทียบความสัมพันธ์ทางสายเลือดร่วมบรรพบุรุษสายแม่เดียวกัน ตำแหน่งนี้ ไม่คิดครับ  และในการเปรียบเทียบระหว่างห้องปฏิบัติการในครั้งนี้ ความคลาดเคลื่อนของการตรวจจำนวน C บริเวณ C-stretch ของ HV1 นี้ ก็ไม่นำมาใช้ในการเปรียบเทียบระหว่างห้องปฏิบัติการครับ

     4. ความคลาดเคลื่อนจากการตรวจลำดับเบส ที่พบในบางห้องปฏิบัติการ เช่นที่ตำแหน่ง 16342D (จำนวน 1 ห้องปฏิบัติการ) และ ตำแหน่ง 16200T (จำนวน 1 ห้องปฏิบัติการ) ซึ่งความคลาดเคลื่อนในการตรวจวิเคราะห์นี้ อาจลดลงได้ โดยการตรวจวเคราะห์ลำดับเบสทั้งสาย forward และ reverse โดยให้ทุกตำแหน่งที่ตรวจพบว่ามีความแตกต่างจาก rCRS ต้องมีการยืนยันจากทั้งสาย forward และ reverse เป็นต้น และการประเมินคุณภาพของการทำ sequence โดยดูจากค่า Q20 ก็เป็นอีกทางหนึ่งที่ช่วยให้ทราบว่า ผลการตรวจวิเคราะห์ลำดับเบสในแต่ละเส้นที่ทดสอบ มีค่าความน่าเชื่อถือมากน้อยเพียงใด หากค่า Q20 ไม่ตกอยู่ในช่วงสีน้ำเงิน อาจต้องพิจารณาทำซ้ำในบางราย ที่ไม่แน่ใจผลการทดสอบบางตำแหน่ง

     กล่าวโดยสรุปของการทำการทดสอบตรวจวิเคราะห์ลำดับเบสบนสายไมโตคอนเดรียทางนิติเวชศาสตร์ เพื่อประเมินความสัมพันธ์ร่วมบรรพบุรุษสายแม่เดียวกันแล้ว ในภาพรวม พบปัญหาหลายประการ ได้แก่

     1. การอ่านไม่ผ่าน C-Stretch โดยเฉพาะอย่างยิ่ง บริเวณ HV2

     2. การตรวจวิเคราะห์ได้ลำดับเบสเหมือนกันแต่บันทึกตำแหน่งที่แตกต่างจาก rCRS ได้แตกต่างกัน

     3. คุณภาพของการตรวจวิเคราะห์ลำดับเบส ได้ค่า Q20 ไม่สูงมากนัก แล้วไม่มีการทำซ้ำ ก่อนการรายงานผลการทดสอบ จึงทำให้ อ่านผลการทดสอบผิดพลาด

     4.การอ่านจำนวน C ในช่วง C-stretch ได้ไม่เท่ากัน

     ซึ่งโดยสรุปแล้ว อาจเป็นเพราะ เรามีความเชื่อมั่นในโปรแกรมเปรียบเทียบลำดับเบส หรือที่เรียกว่า alignment software มากเกินไป จนทำให้เราไม่กล้าที่จะแก้ไขลำดับเบสที่ได้จากการทำ alignment ด้วยโปรแกรมคอมพิวเตอร์ ซึ่งจากประสบการณ์ที่ผ่านมา ผมพบว่า โปรแกรม alignment ทุกโปรแกรม จัดการเปรียบเทียบลำดับเบสให้เราได้เพียงขั้นต้นเท่านั้น หลังจากนั้น ต้องใช้คนมาตรวจสอบความถูกต้องของการเรียงลำดับเบสอีกครั้งหนึ่ง ซึ่งมักพบว่า จำเป็นต้องแก้ไขลำดับเบสในบางตำแหน่ง เสมอ ครับ

     และ การทดสอบนี้ที่ FBI เมื่อใช้โปรแกรมคอมพิวเตอร์แล้ว ใช้คนในการตรวจสอบความถูกต้องแล้ว ยังมีข้อกำหนดอีกว่า ต้องเป็นการวิเคราะห์ความแตกต่างจาก rCRS โดยคน 2 คน ที่ไม่ทราบผลของกันและกัน หากผลการทดสอบออกมาสอดคล้องกันทุกตำแหน่ง จึงจะรายงานผลการทดสอบของตัวอย่างตรวจรายนั้นได้ แต่ถ้าหากผลการทดสอบออกมาไม่สอดคล้องกันในบางตำแหน่ง อาจต้องกลับมาวิเคราะห์กันใหม่ หรืออาจแม้กระทั่งกลับมาเริ่มต้นสกัดดีเอ็นเอเพื่อทำการทดสอบใหม่เลยก็ได้ครับ

     ดังนั้น เครือข่ายนิติพันธุศาสตร์แห่งประเทศไทย จึงควรจัดอบรมเชิงปฏิบัติการ ในเรื่องการตรวจไมโตคอนเดรียทางนิติเวชศาสตร์ ให้ครอบคลุมในเรื่องเหล่านี้ครับ

     1. การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ และการวิเคราะห์ลำดับเบส เพื่อให้สามารถอ่านผลการทดสอบให้ผ่าน C-stretch ให้ได้ครับ

     2. การใช้โปรแกรม ในการทำ alignment และการแก้ไขลำดับเบส

     3. เกณฑ์ในการบันทึกความแตกต่างของลำดับเบสไมโตคอนเดรียบริเวณ control region เมื่อเปรียบเทียบกับสายอ้างอิง rCRS

     นี่ยังไม่รวมไปถึงการวิเคราะห์สถิติในงานการตรวจไมโตคอนเดรีย และการใช้โปรแกรมคอมพิวเตอร์ในการประเมินค่า ความถี่อัลลีลในประชากรไทยนะครับ

     สนุกมั้ยครับ....งานนี้