การพัฒนาวิธีการตรวจวิเคราะห์ฟีคัลโคลิฟอร์มแบคทีเรียในน้ำทะเล ด้วยวิธี membrane filter (บทสรุป)

การพัฒนาวิธีการตรวจวิเคราะห์ฟีคัลโคลิฟอร์มแบคทีเรียในน้ำทะเล ด้วยวิธี membrane filter (บทสรุป)

   หลังจากเราเตรียมความพร้อมทางด้านเอกสารกันแล้ว  และรอสารเคมีที่สั่งซื้อจากเมืองนอกมาพักหนึ่ง เมื่อของพร้อมคนพร้อม เราก็เริ่มดำเนินการตรวจวิเคราะห์ฟีคัลโคลิฟอร์มแบคทีเรียในน้ำทะเลของห้องปฏิบัติการเรากันได้แล้ว  โดยมีขั้นตอนต่างๆ ดังนี้

  1. เตรียมวัสดุอุปกรณ์สำหรับตรวจวิเคราะห์  

   การตรวจฟีคัลโคลิฟอร์มแบคทีเรีย ต้องไม่ให้เกิดการปนเปื้อนจากแหล่งต่างๆ ที่สำคัญ คือ ภาชนะ หรืออุปกรณ์ที่ใช้ในการทดสอบ ได้แก่ 

• กระดาษกรอง
• อุปกรณ์ต่างๆ ที่ใช้ในการตรวจวิเคราะห์  ให้ทำการฆ่าเชื้อ ดังนี้

       - เครื่องแก้ว เช่น Plate  Cylinder  Pipette  ชุดกรอง  ขวดแก้วที่ใช้ในการทดสอบ  ให้หุ้มด้วยอลูมิเนียมฟอยล์ และนำไปอบที่ 170 °C  เป็นเวลา 1 ชั่วโมง

       - ขวดเก็บตัวอย่าง ขวดเจือจาง ขวดบัฟเฟอร์ ให้ทำการฆ่าเชื้อด้วยหม้อนึ่งอัดไอที่ 121 °C  เป็นเวลา 15 นาที

   2. เตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ m-FC Agar

   เตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ m-FC agar ตามวิธีทดสอบที่ห้องปฏิบัติการได้จัดทำขึ้น  แต่การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดนี้จะแตกต่างจากเดิมที่เราเคยเตรียมกันมา เนื่องจากการเตรียม m-FC agar จะต้องใส่ Rosolic acid ลงไปเพื่อเป็นการกำหนดสีของโคโลนีของเชื้อฟีคัลโคลิฟอร์ม และ Rosolic acid สลายได้ง่ายที่อุณหภูมิสูง เราจึงไม่สามารถนำ Agar เข้าทำการฆ่าเชื้อในหม้อนึ่งอัดไอได้  เราทำได้โดยการฆ่าเชื้อภาชนะทุกอย่างที่ต้องใช้ในการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ รวมทั้ง Plate ที่ใช้เทอาหาร โดยทำการละลายอาหารเลี้ยงเชื้อ m-FC agar ที่อุณหภูมิพอเดือดเพื่อให้ Agar ละลาย  แล้วเติม Rosolic acid ลงไป และเมื่ออุณหภูมิของอาหารเลี้ยงเชื้อที่เตรียมไว้ลดลงถึงประมาณ 50 °C  ให้เทอาหารประมาณ 6-7 มล. ลงใน plate ที่ได้ฆ่าเชื้อเตรียมไว้แล้วให้ท่วมแผ่น Absorbent pad   วางทิ้งไว้ให้อาหารแข็ง  แล้วนำเข้าเก็บในตู้เย็น  สามารถเก็บได้เป็นเวลา 72 ชั่วโมง

 

3. ตรวจวิเคราะห์ตัวอย่างน้ำทะเล 

      นำตัวอย่างน้ำทะเลที่ไปเก็บมาจากเกาะสมุย  มาทำการตรวจวิเคราะห์ฟีคัลโคลิฟอร์มแบคทีเรีย  ดังนี้

    - เลือกปริมาตรตัวอย่างที่จะทำการทดสอบ ขึ้นกับระดับการปนเปื้อน

   (เพื่อให้เกิดโคโลนีบนแผ่น Membrane Filter ประมาณ 20-60  โคโลนี)

    - ติดตั้งชุดกรองตัวอย่างที่ผ่านการฆ่าเชื้อกับแท่นกรอง ใช้ปากคีบ คีบแผ่นกรองวางบนฐานกรอง ใช้คีมหนีบให้แน่น

    - ล้างกระดาษกรองด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ 2-3 ครั้ง  เขย่าขวดตัวอย่าง กรองตัวอย่างน้ำในปริมาตรที่ต้องการ ทำการล้างรอบๆ ปากกรวยด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ 2-3 ครั้ง

    - ใช้ปากคีบ คีบแผ่นกรองออกจากชุดกรอง นำไปวางลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อ m-FC Agar วางด้วยความระมัดระวัง อย่าให้เกิดฟองอากาศ แล้วใช้ปากคีบกดขอบกระดาษกรองให้สัมผัสกับอาหารเลี้ยงเชื้อให้ทั่วแผ่น

    - ปิดฝาจานเพาะเชื้อ และทำการเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 44.5 ± 0.2 °C  เป็นเวลา 24 ± 2 ชั่วโมง

    - นับและบันทึกโคโลนีที่ติดสีน้ำเงินที่พบในระดับปริมาตรที่ให้โคโลนีอยู่ในช่วง 20-60 โคโลนี โดยนับโคโลนีที่มีสีน้ำเงินอ่อนถึงเข้มทั่วทั้งโคโลนี หรือบางครั้งอาจพบสีน้ำตาลหรือสีครีมที่กลางโคโลนี  มีลักษณะกลมเรียบ มีเส้นผ่าศูนย์กลางประมาณ 1- 6 มม.

       

   4. การอ่านผลการทดสอบ 

    เลือกระดับการเจือจางที่มีการเจริญของโคโลนีของฟีคัลโคลิฟอร์ม อยู่ในเกณฑ์ที่ยอมรับ เท่ากับ 20-60 โคโลนี/1 แผ่นกระดาษกรอง  และนำไปคำนวณตามสูตร

 

    CFU / 100 ml.         =    จำนวนโคโลนี (typical colony) x 100  

                                     ปริมาตรของตัวอย่างน้ำที่นำมากรอง (ml)

      

   5. ทำการตรวจยืนยันเชื้อที่เจริญบนอาหาร m-FC agar  

    ในช่วงแรกของการตรวจวิเคราะห์ฟีคัลโคลิฟอร์มในน้ำทะเล เนื่องจากผู้ทดสอบยังไม่มีประสบการณ์มาก่อน  การแยกชนิดของเชื้อที่เกิดบนอาหาร m-FC agar  อาจไม่ถูกต้อง  ทำให้ต้องมีการตรวจยืนยันว่าเชื้อที่เจริญเป็นเชื้อ  Fecal  Coliform  Bacteria  ตามขั้นตอนดังนี้

 - เขี่ยโคโลนีที่ต้องการทดสอบว่าเป็น Fecal Coliform ลงใน MacConkey broth

 - ทำการเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35 ± 0.5 °C เป็นเวลา 18-24  ชั่วโมง

 

 - หลอดที่เกิดแก๊สและสีของ MacConkey broth เปลี่ยนเป็นสีเหลือง แสดงว่าเป็นโคโลนีของ  Fecal  Coliform

          

   6. การรายงานผลการทดสอบ 

       6.1 กรณีที่ไม่พบการเจริญของโคโลนีของทุกการเจือจาง ให้รายงาน < 4 CFU/100 ml.    

       6.2 กรณีพบการเจริญของโคโลนีมากกว่า 200 โคโลนี  ให้รายงานเป็น

             TNTC  :  too numerous to count

       6.3 กรณีพบการเจริญของโคโลนีเชื่อมไปยังโคโลนีอื่น จนไม่สามารถนับได้ ให้รายงานเป็น

             CG  :  confluent growth

       6.4 ถ้าไม่มีผลเนื่องจากโคโลนีเติบโตกลืนกันหมด มีจำนวนโคโลนี TNTC หรือเกิดอุบัติเหตุระหว่างการทดสอบ  ให้รายงานผลว่าไม่มีข้อมูลและให้ระบุสาเหตุ

 

     7. ข้อปรับปรุง 

          7.1 การเตรียมอุปกรณ์สำหรับการวิเคราะห์ 

     ในการเตรียมอุปกรณ์ ผู้จัดเตรียมต้องสวมใส่ถุงมือทุกครั้งที่มีการสัมผัสกับอุปกรณ์ต่างๆ และต้องใช้อลูมิเนียมฟอยด์หุ้มอุปกรณ์ทุกชิ้นก่อนทำการฆ่าเชื้อ เพื่อลดการปนเปื้อนที่จะส่งผลต่อการตรวจวิเคราะห์

         7.2 การเลือกปริมาตรน้ำตัวอย่างที่ใช้ทดสอบ 

     จากผลการทดสอบที่ได้ พบว่าจำนวนโคโลนีส่วนใหญ่ไม่อยู่ในช่วง 20-60 โคโลนี   ตามที่วิธีทดสอบกำหนด  ซึ่งอาจทำให้ผลการทดสอบไม่ได้ค่าที่ถูกต้อง   จึงควรทำการปรับปรุงการตรวจวิเคราะห์  โดยการเลือกปริมาตรน้ำตัวอย่างที่ใช้หรือเจือจางตัวอย่างให้เหมาะสม    เพื่อให้ได้ผลของโคโลนีที่เกิดบนอาหารอยู่ในช่วง  20-60  โคโลนี

         7.3  การตรวจวิเคราะห์ 

     การเลือกปริมาตรน้ำตัวอย่างน้ำทะเลที่ใช้ในการทดสอบต้องมีปริมาตรที่พอเหมาะที่จะทำให้ได้โคโลนีของเชื้อที่เกิดบน m-FC agar อยู่ในช่วง 20-60 โคโลนี  เพื่อให้ได้ผลการทดสอบที่เป็นไปตามวิธีทดสอบกำหนด   ซึ่งอาจจำเป็นต้องใช้ประสบการณ์ในการทำการทดสอบเป็นอย่างมาก   

         7.4  การตรวจยืนยันเชื้อ 

     ให้มีการตรวจยืนยันโคโลนีที่เกิดบน m-FC agar โดยการเขี่ยโคโลนีที่สงสัยหรือต้องการยืนยันว่าเป็นฟีคัลโคลิฟอร์มลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ MacConkey broth บ่มเชื้อที่ 35 ± 0.5 °C เป็นเวลา 18-24  ชั่วโมง  โคโลนีที่เกิดแก๊สและเปลี่ยนสีเป็นสีเหลืองถือว่าให้ผล  + 

     จากการศึกษาเอกสารเพิ่มเติมพบว่าสามารถใช้ EC broth เป็นตัวยืนยันเชื้อฟีคัลโคลิฟอร์มได้  ดังนั้นเพื่อให้สะดวกกับการทำงาน  เป็นประหยัดงบประมาณในการซื้ออาหารเลี้ยงเชื้อ  และลดขั้นตอนการทำงานที่ต้องเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อหลายตัว  จึงปรับปรุงให้มีการใช้ EC broth  แทน  MacConkey  broth  ในการตรวจยืนยันเชื้อฟีคัลโคลิฟอร์ม

     8. สรุปผลการพัฒนาการตรวจวิเคราะห์ฟีคัลโคลิฟอร์มในน้ำทะเลของห้องปฏิบัติการ  สำนักงานสิ่งแวดล้อมภาคที่ 14

     จากการพัฒนาวิธีวิเคราะห์หาปริมาณฟีคัลโคลิฟอร์มแบคทีเรียในน้ำทะเล พบว่าห้องปฏิบัติการสามารถตรวจวิเคราะห์ฟีคัลโคลิฟอร์มได้ แต่ต้องทำการปรับปรุงรายละเอียดของการตรวจวิเคราะห์ตามข้อ 6   เพื่อให้ได้ผลการตรวจวิเคราะห์ที่ถูกต้องมากยิ่งขึ้น

     นอกจากนี้การพัฒนาการตรวจวิเคราะห์ฟีคัลโคลิฟอร์มในน้ำทะเลของห้องปฏิบัติการ  ยังเป็นการพัฒนางานที่เกี่ยวข้องกับการตรวจวิเคราะห์ของห้องปฏิบัติการในหลายๆ ด้าน ดังนี้

•  เพิ่มศักยภาพการตรวจวิเคราะห์ของห้องปฏิบัติการให้สามารถตรวจวิเคราะห์ตามมาตรฐานกำหนดได้เพิ่มขึ้น
•  สร้างองค์ความรู้ใหม่ในการตรวจวิเคราะห์แบคทีเรีย ด้วยเทคนิค Membrane filter ให้กับเจ้าหน้าที่ทดสอบ ซึ่งจะเป็นพื้นฐานที่สำคัญในการนำไปใช้ประโยชน์ในการทดสอบเชื้อแบคทีเรียตัวอื่นๆ ที่ใช้เทคนิคเดียวกันนี้
•   สามารถนำข้อมูลที่ได้ไปใช้ประเมินคุณภาพน้ำทะเลในพื้นที่ที่รับผิดชอบในการเฝ้าระวังคุณภาพน้ำทะเลได้อย่างถูกต้องมากยิ่งขึ้น และข้อมูลที่ได้สามารถนำไปใช้ เป็นข้อมูลระดับประเทศได้ เนื่องจากวิธีทดสอบที่ใช้เป็นวิธีเดียวกับที่มาตรฐานกำหนด 

   

[รุ่งอรุณ มงคลนิตย์]

ขอบคุณสำหรับข้อมูลค่ะ  ขอรายละเอียดของอาหารเลี้ยงเชื้อด้วยค่ะ