การเตรียมสไลด์โครโมโซม; ปัญหาที่ยังแก้ไม่ตก (ตอน 2)

วันนี้เป็นตอน 2 แล้ว  มาช่วยกันลุ้นจะมีกี่ตอนถึงจะจบบันทึกนี้  คนอ่านกับคนเขียน ใครจะยอมแพ้ก่อนกัน

วันนี้ที่หน่วยฯ มีการอ่าน journal โดยบุคคลากร young blood ในหน่วยฯ  เป็นเรื่องเกี่ยวกับการเตรียมสไลด์ ปัญหาหนักอกของพวกเรานั่นเอง  อาจจะมีบางคนดวงตาเห็นธรรม บรรลุไปแล้ว แต่ก็อาจจะมีบางคนดวงตายังฝ้าฟาง  พอเห็นเป็นเงาลางๆ  ก็เลยจะขอบันทึก สิ่งที่ได้จากการฟัง(รวมกับที่อ่านเพิ่มเติม) เก็บเอาไว้  ซึ่งอาจจะยังไม่ชัดแจ้งแจ่มแจ๋วทำให้ทุกคนดวงตาเห็นธรรม   ต้องขอให้ทุกท่านเพิ่มเติมความเห็นเข้ามาด้วย(ร่วมด้วย ช่วยกัน)  หรือ เข้ามา disscus ประเด็นที่ผู้บันทึกมองข้ามไปก็จะดีมากเลย

ตอนที่ 1 พูดถึง basic การเลี้ยงและเก็บเกี่ยวเซลล์รวมทั้งการเตรียมสไลด์โครโมโซม ไปแล้ว ตอนที่ 2 ก็ยังต้องขอพูดต่อ เพราะ มีข้อควรระวังในการทำงานอยู่เล็กน้อยที่อยากเตือนไว้ คือ

1. Time of hypotonic treatment  

   -ถ้าเป็นเลือดให้ใช้ 0.075 M  KCL เป็น hypotonic ควรใช้ 12-20 นาที่ ที่อุณหภูมิห้อง 

   -ถ้าเป็น fibroblast cells ให้ใช้ 0.8-1 % soduim citrate เวลาเท่าๆ กัน ไม่ควรนานกว่านี้

   -ถ้านานมาก(45-60 นาที)  จะทำให้ได้โครโมโซมที่มีลักษณะ longer, thicker,sticker, less 

    refinment chromosomes (ให้แปลกันเอง น่าจะเห็นภาพได้ดีกว่า)  

   -ถ้าใช้เวลาน้อยกว่านี้ จะได้สไลด์ที่โครโมโซมยังมี cell membrane และ cell/nuclear debris

    เหลืออยู่รอบๆ

2. High speed centrifugation 

      โดยทั่วไปการเก็บเกี่ยวเซลล์ จะทำให้เซลล์ตกตะกอนโดยการปั่นที่ความเร็ว 800-1000 rpm นาน 10 นาที  แต่การใช้ ความเร็วรอบสูงกว่านี้ คือที่ 6000 rpm นาน 2-5 นาที่ และตบท้ายด้วย 14,000 rpm นาน 2-3 วินาที ก็ให้ผลไม่ต่างกัน ไม่ทำให้เซลล์เกิด "damage"  โครโมโซมที่ได้ยังมีคุณภาพดีพอสำหรับนำไปทำงานขั้นต่อไป

   ซึ่งผู้บันทึกก็เคยลองใช้ความเร็วที่ 6000-7000 rpm เวลา 5-7 นาที ก็ได้โครโมโซมที่มีคุณภาพดี และลดเวลาการทำงานลงไปได้มาก เพราะเราต้องปั่นกันทั้งหมด 6 รอบ  ลดลงไปรอบละ 3-5 นาที รวมแล้วก็ เกือบชั่วโมงทีเดียว

3. long term storage of cell suspension 

     ให้เก็บในรูป cell suspension ใน 1.5-2 มล. microfuge vival จะดีกว่าเก็บในรูปสไลด์โครโมโซม  เพราะจะเก็บได้นานกว่าและใช้เนื้อที่ในการเก็บน้อยกว่า  ทังนี้ต้องเติม fixative หรือ ethanol ให้เต็มและเก็บไว้ที่ -20 องศา หรือ -70 องศา จะดีกว่าที่ 4 องศา เมื่อจะนำมาใช้ให้ปั่นล้าง1 ครั้งด้วย fixative

     การเก็บในรูป cell suspension นั้น จะช่วยคงสภาพ "swollen" ของเซลล์ที่ได้หลังจากเติม hypotonic  และละลายส่วน lipids + proteins ออกจาก nuclear membrane และยังทำให้ membrane อยู่ในสภาพ "fragile" ที่เหมาะกับการนำไปเตรียมสไลด์ (slide preparation)

      เอาละจ๊ะจบตอน2 พร้อมฟังพระราชดำรัสของในหลวงที่มีต่อผู้พิพากษาฯ

 

[โอ๋-อโณ]

ได้ความรู้มากเลยค่ะ ท่านพี่

หากแต่ท่านพี่ ต้องใจจดใจจ่อกับพระราชดำรัสแน่เลยค่ะ พิมพ์ผิดเพียบจน"ยาม" อย่างข้าน้อย "ตาเจ็บ"ไปเลย

ขอให้ท่านพี่กรุณาแก้ไขซะอีกทีด้วยนะคะ เผื่อจะได้รับการเก็บไปตีพิมพ์เป็นตำราในภายภาคหน้า ตามโครงการของ GotoKnow เค้า อันแรกโดดเด่นมากคือ ค ที่ชื่อบันทึก เขาไม่อยู่ค่ะ พากลับมาไวๆนะคะ

[ผู้เฒ่า genetics]

ขอบคุณมากค่ะน้องโอ๋ ที่ทำหน้าที่เป็น "ยาม"  คอยตรวจเชคให้  จริงๆ แล้วเป็น "trick" ของผู้เขียนว่าจะมีคนอ่านไหม อ่านแล้วสังเกตุเห็นอะไรบ้าง จะได้มีการสื่อสาร เขียนถึงกันไง ^^

 

[วีรยุทธ]

พี่คร้าบ ตอนนี้ผมทำตัวอย่างเลือดอยู่ เพื่อซ้อมไปทำโครโมโซมเต่า

ปัญหาที่พบสำหรับผมคือ โครโมโซมไม่สวย แท่งสั้น

ทำมาหลายครั้งแล้ว

แต่ว่าครั้งล่าสุด

ทำแล้วเซลล์ไม่บวม ในที่นี้คือ ผมว่าน่าจะผิดพลาดตอนที่ทำการเติม Hypotonic solution บ่ม 40 นาที แล้วค่อย ๆ เติม Fix

แต่ดันลืม ปั่นตกตะกอน แล้วเติม Fix มากๆเลย

แต่ที่แย่กว่านั้นคือ เรื่องความไสวยของโครโมโซมที่ ผมคิดว่าน่าจะมาจากการเตรียมอาหารที่ pH ไม่แน่นอน คือ ไม่ตรงนั่นเอง

เพราะเป็นโปรเจคปอตรี แล้วของก็ต้องใช้ร่วมกัน

pH meter ก็โดนสารเคมีเยอะเหลือเกิน กลัว ปนเปื้อนด้วยละ

แต่ที่เจอมากนั่นคือ 2 สื่งที่ผมอยากถามพี่

1.ทำงัยให้เซลล์บวมสวยพอดี

2.ทำไมตะกอนเซลลืเยอะจัง

ขอบคุณคร้าบ