การเตรียมสไลด์โครโมโซม; ปัญหาที่ยังแก้ไม่ตก(ตอนที่ 1)
ช่วงนี้ที่หน่วยฯ ยังมีปัญหาการเตรียมสไลด์โครโมโซมอยู่ สไลด์ที่เตรียมได้โครโมโซมที่มีคุณภาพไม่ดีพอให้นำไปย้อมแถบสีต่อ คือ ยังมี cytoplasm, ตัวโครโมโซมก็ยังกระจายไม่ดี ขั้นตอนการ fix โครโมโซมยังเป็นปัญหา กลุ้มใจว่าจะทำอย่างไรดี เลยลองไปค้น paper เก่าๆ พบอยู่ paper หนึ่ง (ที่จริงไม่เก่ามาก เพราะปี 2001 นี่เอง) ที่พูดตรงกับปัญหาเรื่องนี้ จึงอยากเอามาสรุป ให้ young blood genetics ทั้งหลายได้อ่านและศึกษากัน (ถ้าใครต้องการชื่อ paper มาติดต่อกันเป็นส่วนตัวนะ)
โดยสรุป paper นี้บอกว่าการจะได้โครโมโซมที่กระจายดี, cytoplasm น้อย นำไปย้อมแถบสี(GTG-banding) ได้ง่ายนั้นขั้นตอนที่สำคัญอยู่ที่การแห้ง/การระเหยของ Fixative และการแห้ง/การระเหยของ Fixative นั้นก็ขึ้นอยู่กับการมีน้ำมากหรือน้อยในสไลด์ และในอากาศขณะทำสไลด์
ก่อนที่จะไปพูดเรื่องการทำสไลด์จะขอพูดหลักการพื้นฐานของการเพาะเลี้ยงเซลล์, เก็บเกี่ยวเซลล์ และเตรียมสไลด์เพื่อให้ได้โครโมโซมกันก่อน (สูงสุดคืนสู่สามัญตามภาษาบู๊ลิ้ม ซึ่งเป็นเรื่องจริง ก่อนที่จะก้าวไปข้างหน้าควรรู้หลักการพื้นฐานก่อน) ขั้นตอนโดยสรุปจะมีอยู่ 5 ขั้น คือ
1. cell culture คือการเพาะเลี้ยงเซลล์เวิธีการจะขึ้นกับชนิดของ specimen ว่าเป็นอะไร เช่น เป็น เลือด,ไขกระดูก, น้ำคร่ำ หรือ ขิ้นเนื้อ แต่หลักการทั่วไปเหมือนกันคือ ต้องมีอาหารเลี้ยงเซลล์ ซึ่งก็ขึ้นกับชนิดของ specimen โดยทั่วไปมักจะมีการเติมซีรั่ม ซึ่งเป็น supplement ลงไปด้วย และมียาปฏิชีวนะ, สารเคมีที่ทำหน้าที่เป็น buffer ถ้าเพาะเลี้ยงเลือดก็ต้องมี่ PHA เป็นสารกระตุ้น นำไปเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 องศา จุดประสงค์หลักคือการทำเซลล์มีการเจริญเติบโตและแบ่งตัวมากๆ เพื่อให้ได้ mitotic index สูง คือมี metaphase ที่จะให้โครโมโซมมากนั่นเอง
2. harvesting แปลเป็นไทยตรงตัวว่า เก็บเกี่ยวเซลล์ มีขั้นตอนดังนี้
2.1 การทำให้เซลล์หยุดการแบ่งตัวอยู่ที่ระยะ metaphae โดยบล๊อกการสร้าง mitotic spindle สารเคมีที่นิยมนำมาใช้โดยทั่วไปคือ colcemide โดยเติมลงไปใน cell culture หลังจากเพาะเลี้ยงไปได้ระยะหนึ่งจนได้ เซลล์ที่กำลังแบ่งตัวมากพอ
2.2 การทำให้เซลล์บวม (hypotonic treatment) สารละลายที่นำมาใช้จะมีความเข้มข้นน้อยกว่าสารละลายภายในเซลล์ ดังนั้นมันจะไหลผ่าน cell membrane เข้าไปทำให้เซลล์บวมมีขนาดใหญ่ขึ้น และมักทำให้เซลล์เม็ดเลือดแดงแตก ซึ่งจะถูก discard ทิ้งไปได้ง่าย
2.3 การตรึงเซลล์ (fixation) (แปลตามตัว) ขั้นตอนนี้เพื่อทำให้เซลล์คงสภาพ "swollen" และดึงน้ำออกไปจากเซลล์ทำให้โครโมโซมและ biologic material อื่นๆ มีสภาพแข็งขึ้น นอกจากนี้ fixative ที่ใช้คือ 3:1 methanol:acetic acid ยังละลายไขมันและทำให้โปรตีนเสียสภาพ ซึ่งทำให้ cell membraneอยู่ในสภาพ "fragile" ที่จะช่วยในการกระจายโครโมโซมเมื่อเตรียมสไลด์
3. การเตรียมสไลด์ (slide preparation) คือการหยด cell suspension ที่ได้จากขั้นตอนการเก็บเกี่ยวเซลล์ลงบนสไลด์ โดยตั้งความหวังว่าจะได้โครโมโซมที่กระจายตัวดีและนำไปย้อมแถบสีได้ง่าย ขั้นตอนนี้เป็นข้นตอนี่หน่วยฯ กำลังประสบปัญหาอยู่ ดังนั้นจะมีการ discussion อย่างละเอียดต่อไป
4. Aging ถ้าแปลตรงตัวก็ต้องบอกว่าทำให้ โครโมโซมบนสไลด์แก่ แต่ความหมายตรงๆ ก็คือการนำสไลด์โครโมโซมไปอบร้อนหรือทำให้แห้งเพื่อที่จะทำให้โปรตีนเสียสภาพ,น้ำ หรือ fixative ที่ยังหลงเหลืออยู่ระเหยออกไปให้หมด ซึ่งจะช่วยให้เซลล์ติดกับเนื้อแก้วได้ดีขึ้น
5. การย้อมแถบสี (Banding) คือการทำให้เกิดแถบสีบนตัวโครโมโซม ซึ่งจะมี banding pattern เฉพาะตัวของโครโมโซมแต่ละตัวเป็นการ identify โครโมโซมนั่นเอง
คิดว่าบันทึกคราวนี้ต้องมีหลายตอนอีกแล้ว วันนี้ขอจบตอนที่หนึ่งเนี้ก่อน ถ้าพรุ่งนี้ไม่ยุ่งเกินไปจะเขียนต่อตอน 2
ความเห็น (5)
Young blood genetics ทั้งหลายจ๋า คุณมีลูกพี่ Old blood เป็นแบบอย่างในการทำงานที่ดีมากๆ แถมยังใจดี อ่าน paper แล้วมาถ่ายทอดให้ฟัง หนูๆ ทั้งหลาย อย่าทำให้ลูกพี่ผิดหวังนะจ๊ะ
ขอบคุณนะค่ะ
ดิฉันได้ประโยชน์เป็นอย่างมากเพราะทำงานวิจัยเกี่ยงกับเรื่องนี้พอดี
แต่อยากรบกวนส่งเปเปอร์นี้มาให้หน่อยได้ไหมค่ะ
เพราะจะนำมาอ้างอิงงานวิจัยค่ะ
รบกวนด้วยนะค่ะ
ได้ความรู้มากเลยคะ..ตอนนี้กำลังมีปัญหาในส่วนนี้อยู่เหมือนกันคะ..รบกวนขอ paper ในส่วนนี้ด้วยนะคะ..ขอบคุณมากนะคะ