บันทึกจากแดนซากุระ 3: การ run electrophoresis

เทคนิคนี้น่าจะเป็นเรื่องง่ายๆ สำหรับคนที่อยู่ในวงการ molecular แต่สำหรับอีกหลายคนที่ยังไม่มีประสบการณ์อาจเป็นเรื่องวุ่นวายพอสมควร ในฐานะของคนที่ไม่มีประสบการณ์เรื่องนี้มาก่อนก็ขอบันทึกไว้ให้ผู้ที่ไม่มีประสบการณ์เหมือนๆกัน ได้เข้าใจขั้นตอนนี้ให้มากขึ้น

1. ทำไปทำไม?

ทำเพื่อตรวจสอบว่า เมื่อเราสกัด DNA จากตัวอย่างตรวจแล้ว จะแน่ใจอย่างไรว่า ในหลอดทดลองที่เขาบอกว่ามี DNA อยู่นั้น มี DNA อยู่จริง ก็ต้องพิสูจน์กันหน่อย วิธีที่พิสูจน์เรื่องนี้น่าจะมีอยู่ 2 วิธีใหญ่ๆ คือ การ run electrophoresis และการวัด OD ด้วย spectrophotometer

2. แล้วไอ้สองวิธีนี้กันดีต่างกันยังไง?

วิธี electrophoresis จะได้ออกมาเป็น band เทียบกับ marker เราก็จะรู้ว่า DNA ที่ได้มี molecular weigth เท่าไร มีการแตกของเส้น DNA หรือไม่ (fragmentation) ถ้ามีการแตกของเส้น DNA ก็จะมี band ขนาด MW เล็กลง หรือ band ที่ได้ อาจไม่คมชัด  หนักกว่านั้นก็เป็น smear ซึ่งหมายถึงมี DNA ขนาดใกล้เคียงกันเกาะกันเป็นปื้น ทั้งหมดเรียกว่าคุณภาพของ DNAไม่ดี   สำหรับที่ดี คือควรได้ DNA ที่มี band คมชัด ส่วนการวัด OD ด้วย spectrophotometer ที่ 260 nm เป็นการวัดปริมาณ DNA ที่ค่อนข้างแม่นยำ โดย DNA 1 mg/ml จะวัด ODที่ 260 nm ได้ = 20 แต่การวัดปริมาณด้วยวิธีนี้เป็นการบอกเพียงแค่ปริมาณ ไม่ได้บอกคุณภาพของ DNA เหมือนวิธี electrophoresis  อ้อ! เกือบลืมไป จริงๆแล้ววิธี electrophoresis ก็สามารถคำนวณหาปริมาณของ DNA ได้ โดยใช้ standard marker ที่รู้ความเข้มข้นของ marker แล้ววัด intensity ของ band ที่ได้เทียบกับ standard ก็จะรู้ปริมาณของ DNA (หลักการเดียวกับ Densitometer) แต่ปริมาณของ DNA โดยวิธีนี้ อาจไม่แม่นยำเท่ากับวิธีการวัดด้วย spectrophotometer ส่วนใครจะใช้วิธีไหน ก็เลือกเอาตามสบายนะ

3. Gel ที่ใช้มีกี่แบบ?

สำหรับการตรวจสอบ DNA นิยมใช้ 0.5 % agarose gel (ที่นี่ใช้ Agarose Type I มันยังมี Agarose Type II ซึ่งผมยังไม่รู้ว่าเขาใช้ต่างกันอย่างไร ถ้ารู้แล้วค่อยมาบอกทีหลังก็แล้วกัน) ส่วน 2-2.5% agarose นิยมใช้ในการ run PCR product  หาก DNA มีขนาดเล็กมาก เขาก็จะเปลี่ยนไปใช้ polyacrylamide gel แทน

4. แล้วทำไมไม่ใช้ agarose gel สำหรับงาน DNA ที่มีขนาดเล็กล่ะ?

เรารู้ในหลักการว่า DNAขนาดใหญ่จะวิ่งได้ช้า DNA ขนาดเล็กจะวิ่งได้เร็ว  ถ้าต้องการแยก DNA ขนาดเล็กให้มันวิ่งได้ช้าขึ้น ก็เพิ่มความเข้มข้นของ gel ให้สูงขึ้น แต่ agarose gel มีข้อจำกัดในการเตรียม กล่าวคือ ที่ความเข้มข้นมากกว่า 8 % gel จะมีความแข็งมาก เตรียมให้ได้คุณภาพที่ดียาก ก็เลยเปลี่ยนไปใช้ polyacrylamide gel ซึ่งสามารถเตรียมที่ % สูงๆ ได้ดีกว่า แม้กระทั่งที่ 20% ก็ยังไม่มีปัญหา

5. ขั้นตอนการทำเป็นอย่างไร?

เริ่มแรกเตรียม 0.5% agarose gel (0.23g agarose ใน 0.5% TAE buffer 45 ml ผมเตรียมเท่าที่พอใช้ ใครจะเตรียมมากกว่านี้ก็คำนวณเองนะ)  ต้มใน microwave (กะให้ได้อุณหภูมิ 80-90C ที่อุณหภูมิขนาดนี้ มันจะเริ่มเดือดเล็กๆพอเห็นเป็นฟอง ไม่ใช่เดือดพลั่กๆ) เอามาทำให้เย็นโดยแช่น้ำให้ได้อุณหภูมิประมาณ 40-45C ตรวจสอบโดยใช้มือจับแล้วรู้สึกว่าอุ่นน้อยๆ  ที่เขาไม่เท gel ตอนที่ยังร้อนอยู่เนื่องจากวัสดุที่ใช้ทำจากพลาสติก ถ้า gel ร้อนมากๆ พลาสติกอาจงอได้ โดยเท gel ให้สูงประมาณ 5 mm ก่อน แล้วขยับให้ gel ไหลไปทั่วทั้งเพลท แล้วจึงเทเพิ่มให้หมด เสียบ Comb แล้วรอให้ gel แข็ง (ประมาณ 20 นาที) ถอด Comb ออก เช็ดเอาเศษ gel ที่เกาะบนเพลทออก หากยังไม่ใช้ก็เก็บไว้ใน 0.5% TAE buffer ได้ แต่หากจะใช้เลยก็เอาไปใส่ในเครื่อง electrophoresis ที่มี 0.5% TAE buffer อยู่ สังเกตปริมาณ buffer ต้องท่วมเนื้อ gel

ผสม DNA กับสีย้อม โดยใช้อัตราส่วน 5:1 คือ DNA 5 ul ต่อสีย้อม 1 ul ขั้นตอนนี้นิยมทำบนแผ่น paraffin โดยหยดสีย้อมเป็นจุดๆ จุดละ 1 ul ให้เป็นแถวห่างๆกัน แล้วดูด DNA 5 ul เข้าไปผสม แล้วดูดสารทั้งหมดเอามาหยอดใน well ทำเช่นนี้ไปจนหมด อ้อ! อย่าลืมหยอด marker เข้าไปด้วยล่ะ เสร็จแล้ว ทำการ set เครื่อง electrophoresis ที่นี่บังคับให้หันหัว gel (ด้านที่มีหลุมหยอดตัวอย่าง DNA) ไปทางขวามือ เพราะฉะนั้นก็ set ให้ขั้วบวกอยู่ทางซ้าย ขั้วลบอยู่ทางขวา DNA ก็จะวิ่งจากขั้วลบไปทางบวก set Voltage 100 V เวลา 15 นาที (ตอนแรกผมใช้ 30 นาที senseiบอกว่า DNA band ที่ไปมันไปทับกับแถบสี่ย้อม DNA พอดี ก็เลยลดเวลาลง) เสร็จแล้วเอาgel ไปย้อมด้วย Ethidium bromide 10 นาที ก่อนจะนำไปเข้าตู้เปิดแสง UV แล้วถ่ายรูป

5. gel ที่ทำเสร็จแล้ว ถ่ายรูปแล้ว เอาไปไหน?

เท่าที่ผมรู้ บ้านเรานิยมเก็บไว้ เก็บทั้งรูปถ่าย เก็บทั้งแผ่น gel จนสุดท้ายจบโปรเจคแล้วค่อยทิ้งกัน  แต่ที่นี่เขาเอากลับมาใช้ใหม่ พอถ่ายรูปเสร็จเขาก็จะเอา gel ใส่ใน flask พอจะใช้เขาก็เอา gel ใน flask นี้ไปต้ม แล้วเอามาเทเพลทใหม่ได้เลย ใช้ไปหลายครั้ง จนสีของ gel มันเข้มจนรับไม่ได้แล้วค่อยเตรียมใหม่ ถ้าไม่ได้มาเห็นด้วยตาตัวเอง รับรองยังไงก็เลือกเตรียมใหม่ ไม่กล้าใช้ gel เก่าหรอก

จบแล้ว.......

หมายเหตุ :  ผมบันทึกจากที่ได้เรียนรู้ และซักถาม ดังนั้นหากตกประเด็นใดไป หรือเหตุผลประกอบอาจไม่ถูกต้องครบถ้วน ขอเชิญท่านผู้เชี่ยวชาญในงาน molecular ทั้งหลายช่วย comment หรือให้เหตุผลประกอบที่ถูกต้องด้วย เพื่อผู้ด้อยประสบการณ์ทั้งหลายเช่นผม จะได้เข้าใจ และทราบเหตุผลที่แท้จริงครับ

หมายเหตุอีกครั้ง  ใครรู้ช่วยบอกด้วยว่าเขาใส่ คำหลักในบันทึกกันอย่างไร ผมอ่านวิธีการแล้วไม่ค่อยเข้าใจ

[ปารมี]

ถูกใจจังเลย อยากให้มีการบันทึกประสบการณ์เรื่องที่ยากๆ แบบนี้ ให้คนอื่นได้เรียนรู้ด้วย เพราะเทคนิคทาง molecular แม้ทำตาม protocol ทุกขั้นตอน บางที่ก็ได้ผล บางทีไม่ได้ผล จึงคิดว่า คนที่ทำได้ดี คือทำแล้ว success เป็นส่วนใหญ่ น่าจะมี trick อะไรอยู่

[โอ๋-อโณ]

ขออนุญาตเสริมด้วยประสบการณ์จาก Royal Perth Hospital lab ไว้เปรียบเทียบกันด้วยเลยค่ะ ดีด้วยที่เราได้ดูวิธีการของญี่ป่นเทียบกับฝรั่ง ซึ่งคิดว่าน่าสนใจเพราะญี่ปุ่นมีเอกลักษณ์อะไรดีๆที่น่าสนใจมากรวมทั้งวัฒนธรรมในการทำแล็บด้วย

1. เค้าวัด OD โดยไม่ run gel เลยสำหรับขั้นตอน extract DNA แต่วัดทั้ง OD260 และ 280 เพื่อดูการ contaminate ของโปรตีน

2. รู้สึกเค้ามักจะบอกว่า DNA 50 ug/ml จะวัด OD ได้ = 1 มากกว่าเพราะเวลาเราวัด OD ใน spectro ทั่วๆไปจะวัดใน range ที่ไม่เกิน 1 อันนี้แปลกดีนะคะ รู้สึกเพิ่งเคยเจอวิธีการบอกความเข้มข้น DNA จากการวัด spectro แบบนี้ (กลับกันกับฝรั่งเนาะ ตอนแรกอ่านแล้วงงๆ)

3. อยากรู้เหมือนกันนะคะ หาไม่เห็นเห็นจากเน็ทเรื่อง type I, type II agarose เพิ่งเคยได้ยิน ไม่ใช่เกรดมันใช่ไหมคะ

4. ที่เพิธเค้าใช้ 1% agarose ต่ำสุด ไม่ทราบเพราะเค้าประหยัดไม่เท่าหรือเปล่านะคะ

5. ที่เพิธเค้าจะผสม EtBr ลงไปใน agarose gel เลยตอนที่ละลายแล้วให้ได้ความเข้มข้น 0.5 ug/ml ซึ่งทำให้ไม่ต้องเสียเวลาย้อมทีหลัง

วิธีหันทิศทางของ chamber ในการ run ก็ต่างกัน อันนี้ติดใจเพราะแปลกอีกแหละค่ะ ที่ญี่ปุ่นหันซ้ายขวา แต่ฝรั่งจะหันบนล่าง (คือวางให้หลุมหยอดอยู่ด้านใกล้ตัว) แต่การวาง gel tank ทิศไหนไม่มีผลอะไรเพราะยังไงก็ต้องต่อขั้วบวกลบให้ถูกกับวาง gel ให้ DNA วิ่งให้ถูกทางเท่านั้น

6. เรื่องเก็บ gel ไว้ใช้ต่อนี่น่าประทับใจในความประหยัดของเค้านะคะ ส่วนที่เพิธเคยเห็นคนทำเหมือนกัน แต่รู้สึกจะเป็นเพราะความขี้เกียจมากกว่า และใช้สำหรับเช็คขนาด DNA เร็วๆเท่านั้น ที่แล็บ routine เค้าจะทิ้ง gel เลยตั้งแต่ถ่ายรูปเสร็จเพราะเค้าใช้วิธีเก็บรูปเข้าคอมพิวเตอร์

ต้องขอชมว่าบันทึกได้ละเอียดละออ และถามเหตุผลมาได้ดีมากค่ะ ตัวเองตอนทำรู้สึกว่าจะต้องมาหาอ่านเอาเองว่าอะไรใช้ทำไม เพราะคนทำ routine เค้ายุ่งๆแสดงให้ดูเฉยๆ

[mitochodria]

ผมว่าน่าจะเป็นเกรดของ agarose นะ ที่นี่ใช้ของ sigma เอาไว้ไปที่แลบก่อน แล้วจะจด catalog number มาบอก

ส่วนเรื่องเจล ที่นี่ใช้ 0.5% agarose แต่ที่ถามม้อย ม้อยบอกว่าม้อยเตรียม 0.8% เพราะ 0.5% เจลมันอ่อนเกินไป เวลาจะถือไปทางไหนก็ต้องระวัง ถ้าที่เพิธใช้ 1 % ก็แสดงว่า ความเข้มข้นขนาด 0.5-1% น่าจะใช้ได้ทั้งหมด เพียงแต่ต้องชั่งใจเอาเรื่องความประหยัด หรือจะให้เจลแข็งขึ้น เพื่อความสะดวกในการ carry

น่าสนใจนะกับเทคนิคการผสม EtBr ลงไปใน gel ทำให้ไม่ต้องเสียเวลามาย้อมทีหลัง แต่นั่นหมายความว่าเมื่อทำเสร็จต้องทิ้งเจลไปเลย ไม่ควรนำกลับมาใช้ใหม่ เนื่องจาก EtBr เป็น carcinogen อย่างแรง การนำกลับมาใช้ใหม่การเสี่ยงต่อการ direct expose ได้  ไม่รู้ว่า agarose นี่ราคาแพงมากน้อยแค่ไหน แต่ถ้าเน้นประหยัดการนำเจลมาย้อมทีหลังนี้ก็ไม่ได้ยุ่งยากอะไรเพียงแต่เสียเวลาเพิ่มเพียง 10 นาทีเท่านั้น

การถ่ายรูปที่นี่ใช้ image printer พิมพ์ออกมาบน thermal paper พอถ่ายปุ๊บรูปก็พิมพ์ออกมาปั๊บ หรือจะ save เป็น file ก็ได้ สะดวกดีเหมือนกัน ไม่ต้องใช้กล้อง polaroid เหมือนบ้านเรา หรือบางห้องอาจจะทันสมัยไปใช้เครื่องคอมแล้วก็ได้ นี่พูดถึง Sero นะ ยังใช้กล้องอยู่เลย

[mitochondria]

เจ้าตัว agarose นี่ อยู่ 12 type บาง type อาจมีย่อยอีก เป็น 1-a หรือ 1-b เป็นต้น แต่ละ type แยกกันจากลักษณะบางอย่างเช่น

Sulfate content ใช้บอกความบริสุทธิ์ของ agarose

Gel strength ใช้บอกความแข็งของเจล

Gel point ใช้บอกอุณหภูมิที่เริ่มจับตัวกันเป็นเจล

Electroendosmosis (EEO) ในเจลจะมีสารบางอย่างที่เคลื่อนที่สวนทางกับชาวบ้าน ปกติการ run DNA จะเคลื่อนที่จากขั้วลบไปยังขั้วบวก แต่ไอ้เจ้านี่จะเคลื่อนที่จากขั้วบวกไปยังขั้วลบ

agarose ที่ใช้ของที่นี่เป็นของ Sigma ชื่อ agarose type I cat. No. A-6013 เป็นตัวที่ low EEO ส่วนเจ้าตัวปัญหา type II นั่น Cat.No. A-6877 เป็นตัวที่ medium EEO นักเรียนแถวนี้ก็ยังไม่รู้เหมือนกันว่าเอาไว้ใช้ในงานไหน

[แมวน้ำ]

การย้อม EtBr โดยการผสมลงในเจลสะดวกนะคะแต่เสี่ยงต่อการปนเปื้อนโดยเฉพาะ chamber ที่ใช้ และไม่เหมาะกับการที่ต้องรันตัวอย่างที่ใช้เจลยาวๆ เพราะ EtBr มันก็จะเคลื่อนที่ลงมาด้วยทำให้อาจไม่เห็น band DNA ที่อยู่บนๆ

ส่วนเจลที่ใช้แล้วที่แล็บทิ้งไปเลยค่ะ เราเก็บแต่รูป เพราะยังไงๆก็ปนเปื้อน EtBr แล้ว แต่ก้อเคยได้ยินว่าบางแล็บ reuse โดยเค้าจะทำการรันให้ทุกสิ่งทุกอย่างตกเจลไปให้หมด โดยดูได้จากการส่องยูวี (ลำบากเนอะ..เตรียมใหม่ดีกว่า) แล้วค่อยนำมาหลอมใช้ต่อไป

[lucky]

ข้อมูลเป็นประโยชน์อย่างมากเลยคะ ขอบคุณมากๆคะ ^_____^

[augsarawimoot]

ขออนุญาตแสดงความคิดเห็น ในขั้นตอนที่ 5 นั้น ตรงขั้นตอนการ load ตัวอย่าง PCR Product ซึ่งผสมกับ loading dye 5:1 เจ้าตัว loading dye นั้นไม่ใช่สีย้อมนะครับ เป็นตัวที่จะทำให้การ load เจ้า PCR Product ลงไปที่ก้นหลุมโดยไม่ฟุ้งกระจาย และได้ผสมสี เช่น bromophenol blue, xylene cyanol FF, glycerol อีกทั้งเพื่อช่วยบอกระยะทางหรือช่วงที่ DNA วิ่งไปบน Gel electriphoresis ส่วนการย้อม DNAนั้นอยู่ในขั้นตอนการใช้ EtBr หรือ Sybr Gold ฯลฯ นะครับ เพื่อความชัดเจนของข้อมูลครับ