VMA (Vanilmandelic acid ; 3 – methoxy – 4 hydroxymandelic acid) : การทดสอบทำเป็นประจำทุกวันศุกร์ บางสัปดาห์มีตั้งแต่ 1 ราย ถึง 10 ราย แพทย์สั่งตรวจบ่อย

ความสำคัญ

      การตรวจวัดปริมาณ VMA ในปัสสาวะ มีประโยชน์ในการช่วยวินิจฉัยโรคเนื้องอกของอะดรีนาลเมดุลลา ที่เรียกว่า pheochromocytoma 
VMA เป็นเมตาบอไลท์ของฮอร์โมนอีพิเนฟริน (epinephrine) และ นอร์อีพิเนฟริน (norepinephrine) ซึ่งมีชื่อเรียกรวมกันว่าคาทีโคลามินส์ (catecholamines) ซึ่งถูกสร้างจากเซลล์เนื้อเยื่อที่เรียกว่า เซลล์โครมาฟฟิน (chromaffin cells) พบในอวัยวะหลายชนิดในร่างกาย เช่นสมอง หัวใจ ปอด ตับ ลำไส้ และต่อมหมวกไตชั้นในที่เรียกว่า อะดรีนาลเมดุลลา (adrenal medulla) คาทีโคลามินส์ที่ถูกหลั่งเข้ากระแสเลือด และมีการเปลี่ยนแปลงทางเคมีเกิดเป็น คือ VMA  ซึ่งถูกขับถ่ายออกจากร่างกายพร้อมปัสสาวะ
ปริมาณ VMA ในปัสสาวะขึ้นอยู่กับปริมาณฮอร์โมนคาทีโคลามินส์ทุกชนิดในพลาสมารวมกัน โดยทางอ้อม( total catecholamines) การสร้างฮอร์โมนคาทีโคลามินส์มากผิดปกติ ดังนั้นปริมาณคาทีโคลามินส์ในกระแสเลือดจึงมีมากผิดปกติ และทำให้ VMA ที่ถูกขับออกทางปัสสาวะมีปริมาณมากตามไปด้วย การมีฮอร์โมนคาทีโคลามินส์ในพลาสมาสูง ก่อให้เกิดอาการที่สำคัญอย่างหนึ่งในผู้ป่วย คือการมีความดันโลหิตสูง (hypertension) การตรวจวัดปริมาณ VMA ในปัสสาวะจะช่วยให้ทราบถึงสาเหตุของการมีความดันโลหิตสูงในผู้ป่วยว่าเกิดจากโรค pheochromocytoma หรือไม่

หลักการ ( วิธี Azo dye ) 
         VMA ในปัสสาวะจะถูกสกัดออกโดย Ethly acetate ในสารละลายกรดและมีเกลือ sodium chloride อิ่มตัว ต่อมาสกัด VMA ออกจาก Ethly acetate ด้วย  sodium citrate buffer pH 4.0 ปรับสภาพให้เป็นด่างด้วยน้ำยา Potassium carbonate pH 10.4 ในสภาพที่เป็นด่าง VMA จะรวม (couple) กับน้ำยา diazotized paranitroaniline ได้สารมีสี (azo dye stuff) สกัดสารมีสีออกมาจากสารรบกวนอื่น ๆ โดย Normal butanol และวัดเทียบสีที่ 578 nm

น้ำยาที่ใช้

1.     Citrate buffer 0.2 mol/L, pH 4.0 : ชั่ง Citric acid 42.02 gm ละลายน้ำให้ครบ 1 ลิตร และชั่ง sodium citrate 58.82 gm ละลายน้ำให้ครบ 1 ลิตร ผสมสารละลาย Citric acid 85 ml กับสารละลาย sodium citrate 60 ml เข้าด้วยกัน ปรับวัด pH ให้เป็น 4.0
2.     Potassium carbonate 2 mol/L, pH 10.4 : ชั่ง Potassium carbonate 276.42 gm ( 2 mol) ละลายน้ำให้ครบ 1 ลิตร เติมกรด HCl เข้มข้น 50 ml ปรับ pH ด้วยกรด HCl เข้มข้นจนได้ pH 10.4
3.     Sodium metaperiodate 0.2 mol/L : ชั่ง Sodium metaperiodate (NaLO4) 0.43 gm ละลายในน้ำกลั่น 10 ml สารละลายนี้มีอายุ 2 สัปดาห์
4.     สารละลาย Para – nitroaniline 0.1 % W/V : ชั่ง Paranitroaniline (4 – nitroaniline) 0.5 gm ละลายด้วยกรดเกลือเข้มข้น 3 ml แล้วเติมน้ำจนครบ 500 ml น้ำยานี้เก็บได้นานเป็นปีที่อุณหภูมิห้อง
5.     Sodium nitrite 0.05 % W/V : ชั่ง Sodium nitrite 0.05 gm ละลายในน้ำกลั่น 100 ml น้ำยานี้เก็บในตู้เย็นและใช้ได้ 2 เดือน  ควรเตรียมใหม่ ๆ
6.     Ammonium sulfate 0.025 %W/ V : Ammonium sulfate 0.025 gm ละลายในน้ำกลั่น 100 ml เก็บสารละลายนี้ในตู้เย็นและใช้ได้นาน 1 เดือน
7.     Diazotized Paranitroaniline : ผสมสารละลาย Para – nitroaniline 3 ml  กับสารละลาย Sodium nitrite 3 ml เขย่าตั้งทิ้งไว้ 2 นาที เติมสารละลาย Ammonium sulfate 3 ml  เขย่าผสมให้เข้ากัน และใช้น้ำยานี้ภายใน 2 ชั่วโมง น้ำยานี้ต้องเตรียมใหม่ ๆ ก่อนใช้ทุกครั้ง
8.     Hydrochloride acid 2 M : เติมน้ำกลั่นประมาณ 50 ml ลงใน Volumetric flask  ขนาด 100 ml แล้วปิเปตต์กรดเกลือเข้มข้น 16.6 ml ใส่ลงไปช้า ๆ เติมน้ำจนถึงขีด
9.     Sodium Chloride (AR)
10. Ethyl acetate
11. N – butanol (AR)
12. Standard VMA 10 mg% ชั่งกรด DL-3-methoxy-4-hydroxy mandelic acid 10 mg ละลายในน้ำ 100 ml  เก็บที่ –20 0C  ได้ 6 เดือน หรือเก็บในตู้เย็นได้ 3 –4  สัปดาห์ มีความเข้มข้น 100 mg/L เก็บไว้เป็น stock นำ stock มาเจือจางให้มีความเข้มข้นของ VMA เป็น 10, 20, 40 mg/L โดยดูดมา 5,10 และ 20 ml ใส่ลงใน Volumetric flask ขนาด 50 ml. แล้วเติมน้ำจนถึงขีด เก็บในตู้เย็นได้ 2 – 3 สัปดาห์

วิธีทำ (วิธีดัดแปลงของ Gerhard Gumboldt)

  Urine(ml) Urine blank(ml) Standard(ml) Standard blank(ml)
Urine /STD.
HCl 2 M
ผง NaCl  (g.)   
Ethyl acetate

   2.0
   0.2
   1.5
   5.0

   -
   -
   -
   -

    2.0
    0.2
    1.5
    5.0

    -
    -
    -
    -

ปิดจุกเขย่า 1 นาที แล้วนำไปปั่น 5 นาที

ดูดชั้น Ethyl acetate (บน) 4.0 - 4.0 -
Citrate buffer pH 4.0 5.0 - 5.0 -

ปิดจุกเขย่า 1 นาที แล้วนำไปปั่น 5 นาที

ดูดชั้น buffer (ล่าง) - แบ่ง 2.0 2.0 2.0 2.0
Potassium carbonate buffer 3.0 3.0 3.0 3.0
NaIO4 0.5 0.5 0.5 0.5
เขย่า 15 วินาที 6 นาที 15วินาที 6 นาที
Diazotized-p-nitroaniline 0.2 0.2 0.2 0.2
เขย่า 15 วินาที 15วินาที 15วินาที 15 วินาที
n-butanol 4.0 4.0 4.0 4.0

          เขย่าแรง ๆ 10 วินาที แล้วดูดชั้น n-butanol ไปวัด OD ที่ 578 nm โดยใช้น้ำกลั่นเป็น blank

การคำนวณ

    VMA (mg/d)  =  U - UB X CS X Volume urine24 24hr.   
                             S – SB                             100

ค่าปกติ

 1.5 – 8.0 mg/d (ในคนไทยมีรายงานค่าปกติ 1.5 –10 .0 mg/d)  


ค่าปกติของ VMA ใน Random Urine  :
อายุ  1 –5 ปี       =10.42 – 23.64 ug/mg of Creatinine  
       6 – 10 ปี     = 7.07 – 13.57 ug/mg of Creatinine              
     
11 – 15 ปี    = 6.37 – 15.37 ug/mg of Creatinine
    
      
16 – 30 ปี    = 4.57 – 10.67 ug/mg of Creatinine
   
      31 – 60 ปี    = 3.85 – 11.73 ug/mg of Creatinine

ข้อสังเกต

1.     เก็บปัสสาวะ 24 ชั่วโมงใส่ขวดที่มี 6 M HCl จำนวน 10 ml
2.     หากปัสสาวะต่ำกว่า 500 ml ควรเติมน้ำกลั่นให้ครบ 1000 ml แทนปริมาตร 24 ชั่วโมงที่ได้จริง
3.     ปัสสาวะถ้าปรับ pH ให้ต่ำกว่า 2 และเก็บที่อุณหภูมิ  40C จะไม่มีการสลายตัวของ amine ที่มีในปัสสาวะและสามารถเก็บได้นานหลายเดือน
4.     เพื่อขจัดค่าสูงลวงของ VMA ในปัสสาวะ ฉะนั้นในช่วง 3 วันก่อนเก็บปัสสาวะและระหว่างเก็บปัสสาวะต้องให้ subject งดกินสิ่งต่อไปนี้ chocolate, กาแฟ, กล้วยหอม อาหารที่มีวานิลา ผลไม้พวกส้ม ยาต่าง ๆ เช่น Aspirin, Antihypertensive agents (เช่น aldomet)
5. ขั้นตอนการเตรียม  Diazotized Paranitroaniline ให้สังเกตุด้วยว่าเมื่อเติม Sodium nitrite สีของ  Para – nitroaniline  จะต้องจางลงจนแทบไม่มีสีเลย หากสีไม่จางลงให้เตรียมใหม่ โดยลองเขย่าขวดน้ำยา Sodium nitrite ก่อนที่จะผสมกับ Para – nitroaniline  แต่ถ้าหากลองแล้วสีก็ยังไม่ลด อาจเกิดจากน้ำยา Para – nitroaniline  เสื่อม เพราะการเก็บน้ำยา Para – nitroaniline  ต้องระวังเก็บไว้ในขวดที่ทึบแสง