CE2: เขาอ่าน spatial calibration curve กันยังไง

     มีน้องนักศึกษา ปริญญาโท เคยถามว่า สำหรับเครื่องวิเคราะห์ลำดับเบสอัตโนมัติ หรือที่เรียกว่า automate sequencer ของ Applied Biosystem นั้น เขาอ่านกราฟ spatial calibration กันยังไง

     ก่อนที่จะไปถึงคำตอบนั้น เรามาทำความรู้จักกับเจ้า spatial calibration กันดีกว่า

1. เจ้า spatial calibration curve  มีไว้ทำอะไร

     เราเอาไว้ตรวจสอบระบบตรวจจับสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ของ capillary แต่ละอันบน CCD ครับ ว่ายังอยู่ในสภาพที่สมบูรณ์ ไม่ผิดเพี้ยนไป 

2. แล้วจะทำ spatial calibration curve กันเมื่อไรดี

     เราก็จะทำ เมื่อเราเข้าไปยุ่งเกี่ยวกับระบบตรวจจับสัญญาณของเครื่องครับ พูดง่ายๆ ก็คือ เมื่อไรที่เราเข้าไปวุ่นวายกับ เจ้า detection cell ของ capillary array ก็ไอ้เจ้าแท่งแก้วสี่เหลี่ยม ที่เป็นที่รวมของ capillary บน array นั่นแหละครับ เมื่อไรที่เข้าไปขยับมัน จะตั้งใจหรือไม่ตั้งใจก็ตาม ก็เรียกว่าถึงคราวต้องทำ spatial calibration แล้วครับ ทีนี้โดยระบบของการถอด syringe ไปล้าง (สำหรับเครื่องรุ่นที่ใช้ syringe) จำเป็นเปิดฝา oven เปิด detection block ถอดเกลียว array ที่ยึดกับ upper polymer block แล้วดึงขั้ว array ออกจาก block ขั้นตอนนี้ เจ้า detection cell จะถูกกระทบกระเทือน ทำให้มันขยับที่ครับ หรือในขั้นตอนการใส่คืนก็ตาม เจ้า detection cell นี้ก็จะขยับที่เหมือนกันครับ นั่นหมายถึงเวลาที่ต้องทำ spatial calibration curve กันแล้วครับ นี่รวมถึงการเปลี่ยน capillary array อันใหม่ด้วยครับ

3. แล้ว ทำกันอย่างไร

     ก็เพียงแค่ไปที่ spatial run schedule แล้วกดเลือก protocol ครับ มันจะมีให้เลือกเพียง 2 อย่าง คือ SpatialFill กับ SpatialNoFill เจ้าสอง protocol นี้แต่งกันตรงที่จะให้เครื่องมันทำ spatial โดยการเปลี่ยน polymer ใหม่หรือไม่เท่านั้น ถ้าเลือกแบบ Fill เครื่องก็จะเปลี่ยน polymer ใหม่ แล้วค่อยทำ spatial แต่ถ้าเลือกแบบ NoFill เครื่องมันก็จะทำ spatial ให้เลย โดยใช้ polymer เดิมที่อยู่ใน capillary อยู่แล้ว เมื่อเลือกได้แล้ว ก็กดปุ่ม Start ได้เลยครับ

4. แล้วมาถึงคำถามครับ ว่า จะอ่านผลกราฟกันยังไง

     หลักในการอ่านกราฟ โดยสรุป ก็มีประเด็นที่ต้องดูต่างๆดังนี้ครับ

     4.1 เจ้า peak ที่เห็นนี้ เป็น peak ของ capillary แต่ละเส้น สำหรับเครื่องข้างบนเป็นแบบ 4 cap ก็จะมี 4 peak ครับ หากเป็นเครื่อง 16 cap ก็จะมี 16 peak ให้ดูว่าความสูงของ peak ทุก peak ต้องมากกว่า 2,000 ครับ  อย่างเครื่องข้างบนนี้ ตอนซื้อมาใหม่ๆ ได้ความสูง ประมาณ 10,000 นี่ใช้ไปแล้ว ประมาณ 5 ปี ตอนนี้เหลืออยู่ประมาณ 4,000 จะได้ความสูงเท่าไหร่ก็ตาม ให้มากกว่า 2,000 เป็นใช้ได้ครับ

     4.2 peak แต่ละเส้น ต้องไม่มีไหล่ peak ครับ เจ้าไหล่ของ peak ก็คือที่ โคนของ peak ต้องเป็นเส้นลากขึ้นไปยังปลาย peak เลยครับ ไม่ต้องเส้นมายึกยักเป็นไหล่ครับ

     4.3 เส้นกราฟ ระหว่างแต่ละ peak ต้องลงมาจนสุดครับ คือลงมาจนถึง O จะไปค้างโด่เด่อยู่ข้างบนไม่ได้ครับ

     4.4 ปลายแหลมของ peak แต่ละ peak ต้องไม่แตกเป็นลิ้นงูครับ  ลักษณะที่สวยคือเป็นปลายแหลมเปี๊ยว ยอดของปลาย peak จะมีเครื่องหมายกากบาทไว้ครับ

     4.5 spacing ของ capillary แต่ละเส้นทั้งข้างซ้ายและข้างขวา ต้องอยู่ระหว่าง 15-16 ครับ

     หากกราฟ ได้ลักษณะตามที่บอกไว้ ก็ให้กดปุ่ม Accept ครับ ไม่งั้นก็ให้กดปุ่ม Reject หมายถึง ไม่ยอมรับการทำ spatial ครั้งนั้น

     5. แล้วถ้ารูปกราฟ ไม่ได้ตามที่บอกไว้ ทำไงดี

     อย่างที่ว่าไว้ครับ เจ้า spatial calibration มันเอาไว้ตรวจสอบระบบ detection system ของ capillary ถ้าทำ spatial แล้วไม่ได้ ก็ให้สงสัยว่า detection block บน capillary อาจจะสกปรกครับ ก็ให้ถอด detection block ออกมาทำความสะอาดด้วย absolute methanol ครับ อาการนี้ ก็น่าจะหายไป แต่ถ้าไม่หายไปจริงๆ ก็ให้แก้ไขโดยการ rejuvenile capillary คือการทำความสะอาด capillary หรือไม่ก็เปลี่ยน capillary array ใหม่ครับ