GTG ภาคสุดท้าย

ความละเอียดและช่างสังเกตุ จะตรวจพบปัญหาและแก้ไขได้ง่ายๆ

ช่วยกันภาวนาให้เป็นภาคสุดท้ายจริงๆ นะคะ จะได้ไม่ต้องทนอ่านต่ออีกหลายๆ ภาค

   ครั้งนี้ก็ต้องพูดถึงสารเคมีได้แล้ว สารเคมีที่ใช้มีอยู่ 2 อย่าง คือ

1 .สารละลาย trypsin ความเข้มข้น คือ .................. เอ้า young blood ช่วยกันตอบ

2. สี giemsaใน Sorrensen buffer ความเข้มข้น คือ ............... เอ้า young blood ช่วยกันตอบ

(เฉลยหลังงานกีฬาสีคณะ  เอ๊ะ ! หรือว่าไม่ต้องเฉลย ตอบได้ทุกคนไม่พลาดอยู่แล้ว)

สารละลาย trypsin

เนื่องจากความเข้มข้นที่ใช้ค่อนข้างต่ำ ทางน่วยจึงใช้วิธีเตรียมครั้งละ 100-200 มล. แล้วแบ่งใส่

eppendrof เล็กๆ อันละ 1 มล. พอสำหรับใช้ย้อมแถบสีแต่ละครั้ง เก็บแช่แข็งไว้เพื่อไม่ไห้ trypsin เสื่อมสภาพเร็วเกินไป  เวลาจะย้อมแถบสีก็หยิบมาใช้ทีละหลอด

ข้อควรระวังที่อยากเตือน คือ

1. ระหว่างแบ่ง (aliquot) ใส่หลอด eppendrof ให้หมั่นเขย่าบ่อยๆ เพื่อให้ความเข้มข้นของ trypsin คงที่เท่ากันตลอดทุกหลอดที่แบ่ง

2. trypsin เป็นโปรตีนตัวหนึ่ง ดังนั้นขณะที่ใช้งานเมื่อตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องนานๆ แบคที่เรียก็อาจจะเข้าใจผิดได้ว่ามีการตั้งโรงทานบริจาคอาหาร จะมาช่วยกันกินอย่างสนุกสนาน  เมื่อเราย้อมแถบสีเสร็จก็จะได้แบคที่เรียเป็นของแถมติดมาบนสไลด์  ถ้าเอาไปวิเคราะห์ใต้กล้อง นอกจากโครโมโซมแล้วก็จะเห็นแบคที่เรียอ้วนกลมๆ เต็มไปหมด  บางที่ก็บังตัวโครโมโซมทำให้ทัศนวิสัยในการอ่านโครโมโซมเสียไป ดังนั้นเมื่อคิดว่าจะย้อมแล้วควรทำอย่างต่อเนื่องจนเสร็จ ไม่ควรทำๆ หยุดๆ ตั้งทิ้งไว้เป็นชั่งโมงๆ  จะมีแขกไม่รับเชิญไปอยู่บนสไลด์ด้วย 

     นอกจากนี้ ราคา trypsin ก็แพงมากๆ ด้วยทั้งต้องนำเข้ามาจากต่างประเทศ  ล่าสุดเพิ่งสั่งซื้อมา ราคา 13,099 บาท/ 100 กรัม  นั่นคือย้อมครั้งหนึ่งราคาประมาณ10-20 บาท

3. ภาชนะที่ใช้ใส่ trypsin สำหรับย้อม ซึ่งส่วนใหญ่จะเป็น copplin jar ต้องหมั่นล้าง  ด้วยเหตุผลเดิมคือคราบ trypsin จะเป็นตัวเหนี่ยวนำแบคที่เรียอย่างดี

 สี giemsaใน Sorrensen buffer

ข้อควรระวัง

1. สี giemsa ที่หน่วยฯ ใช้เป็นสีที่เตรียมให้โดยหน่วยเตรียมสารละลายของภาคพยาธิ (ถือโอกาสขอบคุณที่ให้บริการมา ณ ที่นี้ด้วย) บางครั้งเราสั่งเตรียมกระชั้นชิดเกินไป  ทางหน่วยเตรียมสารละลายอาจจะ incubate ให้ยังไม่ครบ course  ดังนั้นก่อนจะใช้ขวดใหม่ทุกครั้งควรเชควันที่เตรียม เชคระยะเวลา incubate ให้ดี ถ้าไม่แน่ใจควรโทรฯถามหน่วยเตรียมสารละลาย ถ้าจำเป็นก็ต้อง  incubate อีกครัง  หรือถ้าจะให้ดี  ควรลองใช้ขวดใหม่ในขณะที่ขวดเก่ายังมีเหลือในปริมาณหนึ่ง ถ้ามีปัญหากับขวดใหม่จะได้ยังมีสีใช้ต่อ  ไม่ใช่ขวดเก่าไม่เหลือขวดใหม่ใช้ไม่ได้  งานก็เลยไม่ต้องทำ

2. ต้องเขย่าขวดให้ดีทุกครั้งก่อนใช้  ที่เตือนนี่ไม่ใช่เรื่องตลกเพราะเคยเกิดปัญหามาแล้ว  คือมีอยู่ช่วงหนึ่ง สังเกตุว่าทำไม band มันเห่ยๆ คือจะว่า band ก็ไม่ใช่ ไม่ band ก็ไม่เชิง  เหมือนโครโมโซมอยู่เมืองในหมอก  ก็เลยเชคกันไปเชคกันมาพบว่า เด็กๆ ไม่ได้เขย่าขวดสีก่อนใช้ ดูดแต่ส่วนบนมาใช้  เมื่อเขย่าให้ดีๆ  band ที่ได้ก็ดีตามไปด้วย หมอกหายหมด

3. เนื่องจากสั่งเตรียมแต่ละครั้งจะสั่งเตรียมครั้งละมากๆ (500-1000 มล.) บางช่วง case ไม่มากทำให้สีค้างอยู่นาน  เมื่อนำมาใช้ย้อมต้องใช้เวลานานขึ้นแถบสีที่ได้จึงจะสวย

4. pH ของ Sorrensen buffer ควรจะเป็น 6.8

5. เช่นเดียวกับ trypsin เมื่อคิดจะย้อมก็ให้ทำทีเดียวให้เสร็จเลย ไม่ควรทำๆ หยุดๆ ตั้งทิ้งไว้เป็นชั่งโมงๆ  เพราะจะเกิดเหตุมหัศจรรย์ สีที่เคยใช้ย้อมได้ band สวยๆ ก็จะย้อมไม่ได้ซะเฉยๆ  ต้องเททิ้งเตรียมใหม่  ที่จริงก็ไม่ใช่เรื่องลำบากที่ต้องเตรียมใหม่  แต่มันเปลืองค่ะ เตรียมแต่ละครั้งราคาสีตกประมาณ 10-15 บาท

6. สีที่ใช้ย้อมแล้วหลายๆ สไลด์ (เป็นสิบๆ สไลด์) จะมีปริมาณ trypsin ตกค้างมาก  ดังนั้นสไลด์แผ่นหลังๆ อาจต้องลดเวลาใน trypsin ลง

5. copplin jar ที่ใช้เตรียมสีเพื่อย้อมต้องหมั่นล้าง  ไม่ให้คราบสีเกาะมากเกิน

     ในที่สุดก็จบจนได้  คนเขียนเริ่มเหนื่อยค่ะ  แต่ก็ดีใจที่เขียนจนจบ อาจจะยังไม่ครอบคลุมทุกเรื่องจริงๆ  ถ้าใครมีข้อเสนอแนะ หรือจะช่วยเพิ่มเติมอะไรให้อีก  ก็จะยอดเยี่ยมมาก  (แปลว่ามีคนมาช่วยอ่าน) อยากเห็นข้อเสนอแนะค่ะ

     young blood ทั้งหลายเรื่องต่อไปที่อยากรู้คืออะไรช่วยกันโหวดเข้ามา  อย่ามัวแต่ไปเดินพาเหรดกีฬาสีคณะแพทย์นะจ๊ะพวกผักๆ ทั้งหลาย  มะเขือเทศ(โต้), มะเขือเผา (จนดำ นะ)

[ปารมี]

ตามอ่านมาตั้งแต่ตอนแรก เป็นการบันทึกความรู้ฝังลึกที่ดีมากๆ เทคนิคเล็กๆ น้อยที่ปรากฎ เข้าใจว่าไม่มีเขียนไว้ในตำราฝรั่ง แต่ได้จากประสบการณ์การทำงานที่ใส่ใจในรายละเอียดทุกขั้นตอนของผู้ทำ มีคุณค่ามากๆ 

 

[ผู้เฒ่า genetics]

ขอบคุณ อ.ปารมีที่กรุณาติดตามอ่านมาตั้งแต่ตอนแรก   เป็นอย่างที่อาจารย์ตั้งข้อสังเกตุ  หลายๆ จุดได้จากประสบการณ์การทำงานไม่มีในตำราฝรั่ง  หรือถ้ามีก็ต้องค้นกันเยอะ  จุดประสงค์ของการเขียนคือไม่อยากให้ความรู้เหล่านี้เกษียณไปพร้อมกับตัวเอง  และเป็นต้นทุนไว้ให้เด็กๆ ได้ใช้ในการทำงานในอนาคตค่ะ

[nidnoi]

น่าจะเขียนเป็นหนังสือ  หรือคู่มือปฏิบัติการนะคะ   เรื่องแบบนี้หาอ่านยากค่ะ

[ละอ่อน]

หัวข้อนี้ลงมาก้อหลายวันแล้วแต่ยังไม่มีโอกาสได้เข้ามาตอบคำถามเลย ได้อ่านเกร็ดในการทำ lab จากประสบการณ์จิงแล้วได้รับความรู้เยอะเลย อยากลองตอบคำถามดูแต่ไม่แน่ใจในคำตอบด้วยว่าจะถูกหรือป่าว แต่จะลองตอบดูนะคับ

ความเข้มข้นของ trypsin คือ 0.05g/ml (NSS) ส่วนความเข้มข้นของสี giemsa ใน sorrensen buffer คือ ใช้สีประมาณ giemsa 1 ml ต่อ sorrensen bufferประมาณ 49 ml ซึ่งไม่แน่ใจว่าสี giemsa ที่เตรียมมาความเข้มข้นเป็นยังไง

นี้ก้อหลังกีฬาสีแล้ว รออ่านคำตอบที่ถูกต้องอยู่นะคับ

[ละอ่อน]

เข้าไปหาข้อมูลเพิ่มเติมจาก internet เกี่ยวกับสี giemsa ไม่รู้ว่าเตรียมเหมือนที่เราใช้ใน Lab หรือป่าวนะคับ

การเตรียม stock สี Giemsa

สารเคมีที่ใช้เตรียม:
1.      giemsa powder
2.      glycerol
3.      absolute ethanol

วิธีเตรียม

บด Giemsa powder ด้วยครกบดสี โดยเติม glycerol ในปริมาณเล็กน้อยก่อนแล้วค่อยๆ เติม Giemsa และเติม glycerol ต่อไป โดยใช้ Giemsa 7.5 กรัม และ glycerol 250 มล. บดจนเป็นเนื้อเดียวกัน หลังจากนั้นเติม absolute ethanol 750 มล. ล้างสีออกจากครกให้หมดเก็บใส่ขวด แล้วนำไปบ่มในตู้อบอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส  เปิดจุกทิ้งไว้นาน 2-3 วัน จึงนำไปใช้ได้ ก่อนใช้นำไปละลายใน phosphate buffer โดยใช้ความเข้มข้นของสี Giemsa 20%
การเตรียม phosphate buffer pH 6.8
สารเคมีที่ใช้เตรียม:
1.      KH₂PO₄
2.      Na₂HPO₄
3.      น้ำกลั่น

วิธีเตรียม

          สารละลาย A ชั่ง KH₂PO₄  9.1 กรัม ละลายในน้ำกลั่น 1,000 มล.
          สารละลาย B ชั่ง Na₂HPO₄  9.5 กรัม  ละลายในน้ำกลั่น 1,000 มล.
เวลาใช้นำสารละลาย A 50.8 มล.  ผสมกับสารละลาย B 49.2 มล. เขย่าให้เข้ากัน จะได้ phosphate buffer มี pH ประมาณ 6.8
การเตรียม 20% Giemsa
          โดยการนำ phosphate buffer pH 6.8 มา 80 มล. เติม stock สี Giemsa 20 มล. ผสมให้เข้ากัน    นำไปกรองด้วยกระดาษกรองแล้วนำไปใช้ได้

[NeW GeNeTiCs]

ครั้งต่อไป เรื่องในหน่วย น่าจะนำเรื่อง 5ส ที่จะทำภายในหน่วยมาเสนอบ้าง เพราะได้นำ 5ส มองไม่เห็น แล้วอยากจะได้ความรู้ขยายเพิ่มเติมว่าใน หน่วยน่าจะปรับปรุงในทิศทางไหนต่อไป น่าจะดีนะครับ

[ผู้เฒ่า genetic]

5ส ที่มองไม่เห็นเป็นหัวข้อที่ดี   ยิ่งได้อ่านหนังสือที่หัวหน้าภาคฯกรุณาแจกให้อ่านกันยิ่งทำให้เห็นว่า 5ส ที่มองไม่เห็นนั้นอยู่รอบๆ ตัวเรานั่นเอง  สามารถดัดแปลงมาทำที่หน่วยฯได้ แต่อาจจะไม่ใหญ่พอจะไป show ที่ไหนได้ เช่น การทำสไลด์ให้พอกับงานที่ใช้ อย่าทำมากเกินไป เพราะต้องเสียเวลา banding ต้องเสียสารเคมีที่ใช้ banding และในที่สุดเมื่อมากเกินพอก็ต้องทิ้งบางส่วนไป เสียค่าสไลด์   youong blood ทั้งหลายมีความเห็นว่าอย่างไร ลองเสนอกันดูว่าจะทำอะไรกันได้บ้าง   ว่าแต่หนังสือที่หัวหน้าภาคฯให้อ่านกันนั้นตอนนี้อยู่ที่ไหนจ๊ะ

[แม่หนูจำไม]

บังเอิญจังค่ะ จู่ๆ วันนี้ก็เกิดสงสัยเกี่ยวกับ giemsa (เหล่านี้อาจเป็นคำถามโง่ๆ อย่าหัวเราะกันนะคะ)

1. ทำไมเราถึง ใช้ giemsa ย้อม chromosome ด้วย มีตัวอื่นดีกว่านี้รึเปล่า ทำไมไม่ย้อมแบบ Acid fast stain ล่ะ

2. giemsa ส่วนผสมมาจากอะไร

3. giemsa เข้าไป bind อย่างไร โครงสร้างทางเคมีสัมพันธ์กับ chromosome / DNA อย่างไร affinity เป้นอย่างไร

4. giemsa เกี่ยวกับ AT-rich อย่างไร

5. trypsin เข้าไปมีบทบาทอย่างไร ใช้ enzyme อื่นแทนได้ไหม ผลต่อ chromosome จะดีกว่า trypsin หรือเปล่า

อีกเยอะแยะเลย ถ้าใครรู้ช่วยตอบหน่อยนะคะ search จนมึนแล้วก็ยังม่ clear