เลือก amplify 2 เส้นใหญ่ก่อน ได้แก่ 4F27R และ 26F5R
Primer sequence
4F: AAGCATAATATAGCAAGGACTAACC ตำแหน่งที่ 1814-1838
27R: ATAGAGAGGTAGAGTTTTTTTCGTG ตำแหน่งที่ 11028-11052
26F: CGGCTTCGACCCTATATCC ตำแหน่งที่ 10175-10193
5R: CCATAGGGTCTTCTCGTCTTG ตำแหน่งที่ 2713-2733
ขั้นตอนการทำ PCR
รายละเอียด | ปริมาณ |
DW | 31 ul |
5xBuffer GC | 10 ul |
dNTP (ABI) 2 mM each | 5.5 ul |
primer (each) | 1+1 ul |
Phusion enzyme | 0.5 ul |
DNA template | 1 ul |
PCR condition for 4F27R
Program STMT4F เครื่อง PCR No 1
step | Temperature | Time |
1 | 98C | 30 S |
2 | 98C | 10 S |
3 | 66C | 30 S |
4 | 72C | 6 Min |
5 | Goto step 2 for 35 additional cycles | |
6 | 72C | 10 Min |
7 | 4C | 5 Min |
PCR condition for 26F5R
Program STMT26E เครื่อง PCR No 5
step | Temperature | Time |
1 | 98C | 30 S |
2 | 98C | 10 S |
3 | 72C | 6 Min |
4 | Goto step 2 for 35 additional cycles | |
5 | 72C | 10 Min |
6 | 4C | 5 Min |
run electrophoresis using 0.5% agarose gel (100 ml 0.5x TAE buffer + agarose 0.5 g)
run 100 V 30 min
use 1 kb marker as a ladder
หมายเหตุ ใช้ Agarose type I ของ sigma Cat No A6013-500G
ไม่มีความเห็น